Publications - Institut Salk d'études biologiques

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Martyn, GD, Kalagiri, R., Veggiani, G., Stanfield, RL, Choudhuri, I., Sala, M., Meisenhelder, J., Chen, C., Biswas, A., Levy, RM, Lyumkis, D., Wilson, IA, Hunter, T., Sidhu, SS Utilisation du phage display pour la conception rationnelle d'un anticorps humanisé spécifique de la phosphohistidine 3' à plus haute affinité. (2025) Chimie commune 8(1):381. DOI: 10.1038/s42004-025-01768-9

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Jing, T., Shan, Z., Dinh, T., Biswas, A., Jang, S., Greenwood, J., Li, M., Zhang, Z., Gray, G., Shin, HJ, Zhou, B., Passos, D., Strutzenberg, TS, Aiyer, S., Andrade, L., Zhang, Y., Li, Z., Craigie, R., Engelman, AN, Kvaratskhelia, M., Lyumkis, D. Les structures oligomériques de l'intégrase du VIH-1 révèlent une plasticité fonctionnelle pour l'assemblage de l'intasome et la liaison à l'ARN. (2025) Nature Communications. 16(1):9430. DOI: 10.1038/s41467-025-64479-8

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Zhao, XZ, Li, M., Smith, SJ, Karbasi, A., Choudhuri, I., Jing, T., Lyumkis, D.Craigie, R., Burke, TR Les interactions d'empilement Pi-pi avec l'ADN viral contribuent à la puissance des inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 à base de naphtyridine. (2025) NAR Mol Med. 2(4):ugaf039. DOI : 10.1093/narmme/ugaf039

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La résistance aux médicaments demeure un obstacle majeur à l'identification de traitements efficaces contre l'infection par le VIH-1. Les inhibiteurs de transfert de brin de l'intégrase (INSTI) constituent les traitements de première intention utilisés dans les trithérapies antirétrovirales, mais leur efficacité peut être compromise par l'émergence de mutations associées à la résistance. Le développement de composés conservant leur efficacité contre les variants résistants aux médicaments présente un intérêt considérable. Nous décrivons ici la synthèse d'INSTI à base de naphtyridine comportant une combinaison de groupements 4-amino et 5-hydroxyméthyle. La comparaison des profils de résistance des nouveaux composés avec ceux des INSTI de deuxième génération approuvés par la FDA a montré que les composés candidats présentent une efficacité comparable, voire supérieure, à celle des médicaments utilisés en clinique contre certaines des mutations de résistance les plus fréquentes observées dans les isolats viraux provenant de patients. Les structures d'intasomes du VIH-1, obtenues par cryo-microscopie électronique à haute résolution (cryo-ME), complexées avec deux des meilleurs INSTI à base de naphtyridine, mettent en évidence la manière dont ces inhibiteurs interagissent davantage avec l'ADN viral, notamment grâce à un empilement optimisé de l'ADN. Des simulations de dynamique moléculaire, combinées à des calculs de mécanique quantique et de mécanique moléculaire, indiquent que l'interaction entre les liaisons intramoléculaires, la géométrie d'empilement, les effets de résonance et la distribution des charges régit la liaison du médicament au sein du site actif de l'intasome. Ces données expliquent mécanistiquement comment des interactions clés contribuent à une meilleure activité antivirale contre les mutants résistants aux médicaments et mettent en lumière une nouvelle stratégie pour lutter contre la résistance au VIH-1.

Li, Z., Burgos-Bravo, F., Xu, K., Li, C., Kwan, KY, Tong, AB, Shan, Z., Wang, H., Takaku, M., Li, J., Shi, Z., Lyumkis, D., Bustamante, C., Fei, J. Les condensats NDF-FACT à phases séparées facilitent l'élongation de la transcription sur la chromatine. (2025) Biologie cellulaire naturelle. DOI: 10.1038/s41556-025-01778-8

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Rodriguez, ZK, Andino-Moncada, JR, Buth, SA, Mehrani, A., Ranaweera, A., Shi, J., Andrade, LR, Singh, SP, Strutzenberg, TS, Marin, M., Guerrero-Ferreira, R., Rahmani, H., Grotjahn, DA, Stagg, S., Melikyan, GB, Lyumkis, D., Francis, AC Imagerie de fluorescence résolue dans le temps et tomographie cryoélectronique corrélative pour étudier les changements structurels de la capside du VIH-1. (2025) ACS Nano. DOI : 10.1021/acsnano.5c06724

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La capside conique du VIH-1 protège le génome viral interne et facilite l'infection des cellules cibles. Des antiviraux très puissants, comme le lénacapavir (LEN), un médicament cliniquement approuvé, bloquent la réplication du VIH-1 en modifiant la structure de la capside et en modulant sa fonction. Cependant, les études structurales de la capside du VIH-1, de son désassemblage ou de sa stabilisation par des antiviraux se sont révélées difficiles. Nous avons développé ici un protocole de microscopie optique et cryoélectronique corrélative (CLEM) pour caractériser la morphologie de la capside du VIH-1, à partir d'un petit volume de particules virales récoltées dans des surnageants cellulaires. Nous rapportons deux améliorations cruciales dans la préparation des échantillons : (1) la capture par affinité et la rétention de particules fluorescentes du VIH-1 sur des grilles cryo-EM afin de permettre la cartographie de la localisation virus/capside avant la vitrification des échantillons ; et (2) des protocoles d'alignement simplifiés pour identifier et corréler ultérieurement les régions d'intérêt dans les images de fluorescence et cryo-EM. Ces améliorations permettent un flux de travail CLEM reproductible pour localiser avec précision les capsides lors des études de cryo-tomographie électronique (cryo-ET). Grâce à cette approche, nous avons résolu les ultrastructures des capsides du VIH-1 traitées par LEN et le métabolite cellulaire inositol hexaphosphate (IP6), révélant différents modes de stabilisation du réseau capsidique. Enfin, grâce à notre flux de travail CLEM, nous démontrons la faisabilité de la corrélation entre l'imagerie de fluorescence à temps résolu du désassemblage de la capside et les structures cryo-ET finales. Ces avancées faciliteront les études structurales in vitro afin de définir les mécanismes de stabilisation et de désassemblage de la capside du VIH-1. Le flux de travail CLEM développé ici peut également être étendu à l'étude des modifications structurelles d'autres virus en réponse à divers stimuli.

Sheng, K., Dong, X., Aiyer, S., Lee, J., Đorđević-Marquardt, S., Lyumkis, D., Williamson, JR Sondage d'oligonucléotides antisens comme plate-forme structurelle pour l'étude de l'assemblage de complexes ribonucléoprotéiques. (2025) Nature Communications. 16(1):6642. DOI: 10.1038/s41467-025-61640-1

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Sun, Q., Aiyer, S., Biswas, A., Haldane, A., Chatterjee, S., Matubayasi, N., Lyumkis, D., Levy, RM Hydratation de novo des reconstructions cryo-EM par simulations de dynamique moléculaire du potentiel chimique en excès. (2025) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2025.05.23.655847

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Biswas, A., Choudhuri, I., Huang, K., Sun, Q., Sali, A., Echeverria, I., Haldane, A., Levy, RM, Lyumkis, D. Séquence évolutive et base structurelle des origines épistatiques de la résistance aux médicaments dans le VIH. (2025) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2025.04.30.651576

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L'émergence d'une résistance aux médicaments chez le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) demeure un défi majeur pour l'efficacité à long terme du traitement antirétroviral (TAR). De plus en plus de données probantes soulignent le rôle crucial de l'épistasie, c'est-à-dire la dépendance des effets mutationnels au contexte séquencé, dans la définition du profil d'aptitude du VIH sous la pression de sélection induite par le TAR. Cependant, les origines biophysiques des interactions épistatiques impliquées dans l'apparition des mutations de résistance aux médicaments (MRM) restent floues. Les corrélations mutationnelles sont-elles intrinsèques aux propriétés de la protéine ou résultent-elles de la liaison aux médicaments ? Nous utilisons un modèle statistique d'énergie de covariance de séquence de Potts, basé sur des séquences protéiques du VIH-1 dérivées de patients, pour construire des cycles informatiques de doubles mutants qui sondent l'épistasie par paires de toutes les mutations observées au niveau des trois principales enzymes cibles des médicaments antirétroviraux. Nous constatons que les effets épistatiques les plus importants se produisent entre les mutations situées sur des positions de résidus qui mutent fréquemment au cours du TAR, appelées positions associées à la résistance. Afin d'étudier les origines structurelles des interactions épistatiques les plus fortes, nous avons réalisé une centaine de simulations de dynamique moléculaire par perturbation d'énergie libre. Ces simulations révèlent que la principale contribution à l'épistasie par paires entre les DRM provient d'effets coopératifs sur la stabilité et le repliement des protéines, conséquence intrinsèque du paysage mutationnel des protéines. L'ensemble de ces résultats renforce un mécanisme d'évolution de la résistance par lequel les virus échappent à la pression médicamenteuse en provoquant sélectivement des mutations sur des sites intrinsèquement couplés, ce qui leur permet d'atténuer de manière coopérative les effets néfastes de chaque DRM sur leur fitness.

Strutzenberg, TS, Mann, MD, Li, X., Shin, H., Kelsey, J., Aiyer, S., Yu, J., Gray, G., Zhang, Z., Shan, Z., Zhou, B., Zheng, Y., Griffin, PR, Lyumkis, D. L'engagement des nucléosomes régule la structure et la dynamique du RORγt. (2025) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2025.03.10.642251

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Horton, Caroline du Nord, Lyumkis, D. Structures, mécanismes et avantages cinétiques du mécanisme de formation des filaments SgrAI. (2024) Revues critiques en biochimie et biologie moléculaire.:1-39 DOI: 10.1080/10409238.2024.2440315

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Cette revue documente les recherches ayant conduit à la découverte sans précédent de la filamentation comme mode de régulation enzymatique dans l'endonucléase de restriction de type II SgrAI. La filamentation est définie ici comme la polymérisation linéaire ou hélicoïdale d'une seule enzyme, comme c'est le cas pour SgrAI, et il a maintenant été démontré qu'elle se produit dans de nombreux autres systèmes enzymatiques, y compris les enzymes métaboliques conservées. Dans le cas de SgrAI, la filamentation multiplie par 1000 XNUMX le taux de clivage de l'ADN et modifie également la spécificité de la séquence d'ADN de l'enzyme. Les recherches ont débuté par l'observation que SgrAI clive deux types de séquences de reconnaissance, primaires et secondaires, mais ne clive les séquences secondaires que lorsqu'elles sont présentes sur le même ADN qu'au moins une séquence primaire. Les mesures du taux de clivage de l'ADN ont montré que la séquence primaire est à la fois un substrat et un effecteur allostérique de SgrAI. Les mesures biophysiques ont indiqué que la forme activée de SgrAI, stimulée par la liaison à la séquence primaire, était constituée d'un nombre variable de SgrAI liés à l'ADN. Des études structurales ont révélé que l'état activé de SgrAI se présente sous la forme d'un filament hélicoïdal gauche qui stabilise une conformation enzymatique altérée, laquelle lie un second cation divalent dans le site actif. Des travaux sont en cours pour déterminer le mécanisme d'altération de la spécificité de la séquence d'ADN et les modèles actuels sont discutés. Enfin, la modélisation cinétique globale de la réaction de clivage de l'ADN médiée par le filament et les simulations d'activité suggèrent que le mécanisme du filament a évolué pour cliver rapidement l'ADN envahissant tout en protégeant le génome de l'hôte.

Martyn, GD, Kalagiri, R., Veggiani, G., Stanfield, RL, Choudhuri, I., Sala, M., Meisenhelder, J., Chen, C., Biswas, A., Levy, RM, Lyumkis, D., Wilson, IA, Hunter, T., Sidhu, SS Utilisation de l'affichage de phages pour l'ingénierie rationnelle d'un anticorps humanisé spécifique de la phosphohistidine 3' à affinité plus élevée. (2024) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.11.04.621849

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La phosphorylation de l'histidine (pHis) est une modification post-traductionnelle (MPT) non canonique, historiquement peu étudiée en raison du manque de réactifs robustes nécessaires à son étude, tels que les anticorps spécifiques du pHis à haute affinité. La conception d'anticorps spécifiques du pHis est très complexe en raison de la labileté de la liaison phosphoramidate (PN) et des exigences strictes de reconnaissance sélective des deux isoformes, la 1-phosphohistidine (1-pHis) et la 3-phosphohistidine (3-pHis). Nous présentons ici une stratégie de conception d'anticorps pour la détection de cibles natives du pHis 3. Plus précisément, nous avons humanisé l'anticorps monoclonal SC44-8 anti-3-pTza (un mimétique stable du pHis 3) de lapin pour en faire un support (appelé ici hSC44) adapté à la présentation sur phage. Nous avons ensuite construit six bibliothèques Fab uniques, présentées sur phage, à l'aide de l'échafaudage hSC44 et sélectionné des liants 3-pHis de haute affinité. Notre stratégie de sélection a été soigneusement conçue pour enrichir les anticorps se liant à 3-pHis avec une forte affinité et présentant une spécificité pour 3-pHis par rapport à 3-pTza. hSC44.20N32F, le meilleur anticorps modifié, présente une affinité pour 10-pHis environ 3 fois supérieure à celle du hSC44 parental. Onze nouvelles structures Fab, dont les premières structures peptidiques anticorps-pHis rapportées, ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Des calculs structuraux et de mécanique quantique ont fourni des informations moléculaires sur la discrimination 3-pHis et 3-pTza par différents variants de hSC44 et sur l'augmentation de leur affinité obtenue par ingénierie. De plus, nous démontrons l'utilité de ces nouveaux anticorps spécifiques 3-pHis de haute affinité pour la reconnaissance des protéines pHis dans les cellules de mammifères par immunoblot et coloration par immunofluorescence. Dans l’ensemble, notre travail décrit une méthode générale d’ingénierie d’anticorps spécifiques au PTM et fournit un ensemble de nouveaux anticorps pour des recherches plus approfondies sur le rôle du 3-pHis en biologie cellulaire.

Shan, Z., Rivero-Gamez, A., Lyumkis, D., Horton, Caroline du Nord Mécanisme de clivage de l'ADN par deux ions métalliques par SgrAI filamenteux activé. (2024) Journal de chimie biologique.:107576 DOI: 10.1016/j.jbc.2024.107576

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Les enzymes formant des assemblages filamenteux aux activités enzymatiques modulées ont suscité un intérêt croissant ces dernières années. SgrAI est une endonucléase de restriction de type II spécifique de séquence qui forme des filaments polymères avec une activité de clivage accéléré de l'ADN et une spécificité de séquence d'ADN étendue. Des études antérieures ont suggéré un modèle mécaniste reliant les changements structurels accompagnant la filamentation de SgrAI à son activité de clivage accéléré de l'ADN. Dans ce modèle, les changements conformationnels spécifiques à SgrAI filamenteux maximisent les contacts entre les différentes copies de l'enzyme au sein du filament et créent un second site de liaison de cation divalent dans chaque sous-unité, ce qui facilite la réaction de clivage de l'ADN. Cependant, notre compréhension du mécanisme atomique de la catalyse est incomplète. Nous présentons ici deux nouvelles structures de SgrAI filamenteux résolues par cryomicroscopie électronique (cryo-EM). La première structure, résolue à 3.3 Å, est celle de SgrAI filamenteux contenant une mutation du site actif conçue pour bloquer la réaction de clivage de l'ADN, révélant ainsi la configuration enzymatique avant le clivage. La seconde structure, résolue à 3.1 Å, est celle de SgrAI filamenteux sauvage contenant l'ADN substrat clivé, révélant ainsi la configuration enzymatique à la fin de la réaction de clivage. Les deux structures contiennent la fraction phosphate au site de clivage et le cofacteur cationique bivalent biologiquement pertinent Mg, et définissent la reconfiguration du cation Mg lors de la catalyse enzymatique. Les données étayent un modèle du mécanisme d'activation impliquant la liaison d'un second Mg au site actif de SgrAI, conséquence directe des changements conformationnels induits par la filamentation.

Dong, X., Sheng, K., Gebert, LFR, Aiyer, S., MacRae, IJ, Lyumkis, D., Williamson, JR Assemblage du ribosome bactérien avec ARNr circulairement permuté. (2024) Recherche sur les acides nucléiques. DOI : 10.1093/nar/gkae636

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Van Veen, D., Galaz-Montoya, JG, Shen, L., Baldwin, P., Chaudhari, AS, Lyumkis, D., Schmid, MF, Chiu, W., Pauly, J. Achèvement du coin manquant via l'apprentissage non supervisé avec des réseaux de coordonnées. (2024) Int J Mol Sci. 25(10). DOI : 10.3390/ijms25105473

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Sheng, K., Dong, X., Aiyer, S., Lee, J., Marquardt, SD, Lyumkis, D., Williamson, JR Consolidation de domaine dans l'assemblage bactérien 50S révélée par sondage d'oligonucléotides antisens. (2024) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.05.08.593220

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Biswas, A., Choudhuri, I., Arnold, E., Lyumkis, D., Haldane, A., Levy, RM Les modèles coévolutifs cinétiques prédisent l’émergence temporelle de mutations de résistance au VIH-1 sous la pression de la sélection des médicaments. (2024) Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique. 121(15):e2316662121. DOI : 10.1073/pnas.2316662121

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La résistance aux médicaments du VIH de type 1 (VIH-1) est un problème omniprésent qui affecte la vie de millions de personnes dans le monde. Bien que les données sur les mutations pharmacorésistantes (MR) aient été largement compilées dans des bases de données publiques, notre compréhension de la cinétique évolutive de ces mutations et de leur évolution conjointe reste limitée. L'épistasie, c'est-à-dire l'interaction entre une MRD et d'autres résidus dans les séquences protéiques du VIH-1, est essentielle à l'évolution temporelle de la résistance aux médicaments. Nous utilisons un modèle statistique-énergie de Potts à covariance de séquences de l'aptitude des protéines du VIH-1 sous pression de sélection médicamenteuse, qui capture les interactions épistatiques entre toutes les positions, combiné à des simulations cinétiques de Monte-Carlo des trajectoires évolutives des séquences, pour étudier l'acquisition des MRD lors de leur apparition dans un ensemble de séquences protéiques de patients naïfs de traitement. Nous suivons l'évolution temporelle de 52 MRD dans les enzymes protéase, transcriptase inverse et intégrase, principales cibles des traitements antirétroviraux. Les taux d'émergence des DRM sont fortement corrélés à leurs taux d'acquisition observés dans la littérature sous pression médicamenteuse. Ce résultat souligne le rôle central de l'épistasie dans la détermination de la cinétique d'émergence des DRM. Alors que les DRM à acquisition rapide commencent à s'accumuler dès l'application de la pression médicamenteuse, les DRM à acquisition lente dépendent de mutations accessoires qui n'apparaissent qu'après une pression médicamenteuse prolongée. Nous fournissons les bases de l'utilisation de méthodes informatiques pour déterminer l'évolution temporelle de la résistance aux médicaments grâce aux potentiels statistiques de Potts, qui peuvent être utilisés pour obtenir des informations mécanistiques sur les voies de résistance aux médicaments du VIH-1 et d'autres agents infectieux.

Dong, X., Sheng, K., Gebert, LFR, Aiyer, S., MacRae, IJ, Lyumkis, D. Assemblage du ribosome bactérien avec un ARNr circulairement permuté (2024) bioRxiv. DOI: https://doi.org/10.1101/2024.04.10.588894

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Aiyer, S., Baldwin, PR, Tan, SM, Shan, Z., Oh, J., Mehrani, A., Bowman, ME, Louie, G., Passos, DO, Đorđević-Marquardt, S., Mietzsch, M., Hull, JA, Hoshika, S., Barad, BA, Grotjahn, DA, McKenna, R., Agbandje-McKenna, M., Benner, SA, Noel, JAP, Wang, D., Tan, YZ, Lyumkis, D. Surmonter l'atténuation de la résolution lors de la collecte de données cryo-EM inclinées. (2024) Nature Communications. 15(1):389. DOI: 10.1038/s41467-023-44555-7

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Sun, Q., Biswas, A., Lyumkis, D., Levy, R., Deng, N. Élucidation des déterminants moléculaires des modes de liaison d'un inhibiteur de transfert de brin de l'intégrase du VIH-1 de troisième génération : l'importance de la réorganisation de la chaîne latérale et du solvant. (2024) Virus. 16(1). DOI : 10.3390/v16010076

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Les inhibiteurs du transfert de brin de l'intégrase (IN) du VIH-1 (INSTI) de première et deuxième générations, utilisés en clinique, sont des composants clés du traitement antirétroviral (TAR). Ils agissent en bloquant l'étape d'intégration du cycle de réplication du VIH-1, catalysée par un assemblage nucléoprotéique appelé intasome. Cependant, même les INSTI les plus récents, utilisés en clinique, commencent à développer une résistance. Les INSTI de troisième génération, en cours de développement, basés sur des échafaudages de naphtyridine, sont des candidats prometteurs pour lutter contre les variants viraux résistants aux médicaments. Parmi ces nouveaux INSTI, un composé présente deux conformations distinctes lors de sa liaison aux intasomes du VIH-1 et du prototype du virus spumeux (PFV), étroitement apparenté, malgré la forte similarité structurelle de leurs poches de liaison aux INSTI. Le mécanisme moléculaire et les principaux résidus du site actif responsables de ces différents modes de liaison dans les intasomes étroitement apparentés restent incertains. Afin de démêler les déterminants moléculaires régissant les deux modes de liaison distincts, nous avons appliqué une nouvelle méthode d'énergie libre basée sur la dynamique moléculaire. Cette méthode utilise des voies alchimiques pour surmonter les difficultés d'échantillonnage liées à la transition entre les deux conformations liées du ligand dans les environnements encombrés des poches de liaison INSTI de ces intasomes. Les énergies libres conformationnelles calculées récapitulent avec succès les préférences de mode de liaison observées expérimentalement dans les deux intasomes viraux. L'analyse des structures simulées suggère que les préférences de mode de liaison observées sont causées par des différences de résidus d'acides aminés dans la sous-poche catalytique frontale et centrale du site de liaison INSTI chez le VIH-1 et le PFV. Des calculs d'énergie libre supplémentaires sur des mutants du VIH-1 et du PFV ont révélé que, si les deux sous-poches contribuent à la sélection du mode de liaison, la sous-poche centrale joue un rôle plus important. Ces résultats soulignent l’importance de la réorganisation de la chaîne latérale et du solvant, ainsi que de l’entropie conformationnelle dans la détermination du mode de liaison du ligand, et contribueront à éclairer le développement d’INSTI plus efficaces pour lutter contre les variantes virales résistantes aux médicaments.

Jing, T., Shan, Z., Dinh, T., Biswas, A., Jang, S., Greenwood, J., Li, M., Zhang, Z., Gray, G., Shin, HJ, Zhou, B., Passos, D., Aiyer, S., Li, Z., Craigie, R., Engelman, AN, Kvaratskhelia, M., Lyumkis, D. Les structures oligomériques de l'intégrase du VIH-1 révèlent une plasticité fonctionnelle pour l'assemblage de l'intasome et la liaison à l'ARN. (2024) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.01.26.577436

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Haack, DB, Rudolfs, B., Zhang, C., Lyumkis, D., Toor, N. Base structurelle de la ramification lors de l'épissage de l'ARN. (2023) Biologie structurale et moléculaire de la nature. DOI: 10.1038/s41594-023-01150-0

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Oh, J., Shan, Z., Hoshika, S., Xu, J., Chong, J., Benner, SA, Lyumkis, D., Wang, D. Une géométrie Watson-Crick unifiée pilote la transcription d'alphabets d'ADN étendus à six lettres par l'ARN polymérase d'E. coli. (2023) Nature Communications. 14(1):8219. DOI: 10.1038/s41467-023-43735-9

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Xie, L., Bowman, ME, Louie, GV, Zhang, C., Ardejani, MS, Huang, X., Chu, Q., Donaldson, CJ, Vaughan, JM, Shan, H., Powers, ET, Kelly, JW, Lyumkis, D., Noël, JP, Saghatelian, A. Biochimie et interactions protéiques de la microprotéine CYREN. (2023) Biochimie. DOI : 10.1021/acs.biochem.3c00397

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Sheng, K., Li, N., Rabuck-Gibbons, JN, Dong, X., Lyumkis, D., Williamson, JR Paysage d'assemblage de la grande sous-unité ribosomique bactérienne. (2023) Nature Communications. 14(1):5220. DOI: 10.1038/s41467-023-40859-w

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Li, M., Oliveira Passos, D., Shan, Z., Smith, SJ, Sun, Q., Biswas, A., Choudhuri, I., Strutzenberg, TS, Haldane, A., Deng, N., Li, Z., Zhao, XZ, Briganti, L., Kvaratskhelia, M., Burke, TR, Levy, RM, Hughes, SH, Craigie, R., Lyumkis, D. Mécanismes de résistance de l'intégrase du VIH-1 au dolutégravir et puissante inhibition des variantes résistantes aux médicaments. (2023) Progrès de la science 9(29):eadg5953. DOI : 10.1126/sciadv.adg5953

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Dong, X., Doerfel, LK, Sheng, K., Rabuck-Gibbons, JN, Popova, AM, Lyumkis, D., Williamson, JR L'assemblage in vitro quasi physiologique des ribosomes 50S implique des voies parallèles. (2023) Recherche sur les acides nucléiques. DOI : 10.1093/nar/gkad082

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Lyumkis, D., Horton, Caroline du Nord Le rôle de la filamentation dans l'activation et la spécificité de la séquence d'ADN de l'endonucléase spécifique de séquence SgrAI. (2022) Transactions de la Société biochimique. DOI : 10.1042/BST20220547

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La formation de filaments par des enzymes métaboliques, biosynthétiques et autres est récemment apparue comme un mécanisme permettant d'affiner l'activité enzymatique dans la cellule. La filamentation est essentielle au fonctionnement de SgrAI, une endonucléase d'ADN séquencée spécifique qui a servi de système modèle pour fournir des informations parmi les plus approfondies sur les caractéristiques biophysiques de la filamentation et ses conséquences fonctionnelles. Les analyses structure-fonction révèlent qu'à l'état filamenteux, SgrAI stabilise une conformation enzymatique activée, ce qui entraîne une accélération du clivage de l'ADN et une spécificité accrue de la séquence d'ADN. Cette dernière serait médiée par la structure de l'ADN séquencée spécifique, les interactions protéine-ADN et une transition du désordre vers l'ordre dans la protéine, qui affectent collectivement les stabilités relatives de la conformation inactive, non filamenteuse, et de la conformation active, filamenteuse, de SgrAI liée à l'ADN. La modélisation cinétique globale complète de la voie de clivage de l'ADN révèle une constante de vitesse d'association de second ordre, lente et limitante, pour l'assemblage des filaments. Des simulations d'activité in vivo prédisent que la filamentation est supérieure aux mécanismes non filamentaires pour assurer une activation et une séquestration rapides de l'activité de clivage de l'ADN de SgrAI sur l'ADN du phage et loin du chromosome hôte. Des études in vivo démontrent l'importance cruciale d'un clivage accéléré de l'ADN par SgrAI dans son rôle biologique de protection de l'hôte bactérien. Collectivement, ces données ont permis de mieux comprendre comment la filamentation peut réguler la structure et la fonction des enzymes, tandis que les stratégies expérimentales utilisées pour SgrAI peuvent être appliquées à d'autres systèmes enzymatiques afin d'identifier de nouveaux rôles fonctionnels de la filamentation.

Sheng, K., Li, N., Rabuck-Gibbons, JN, Ding, X., Lyumkis, D., Williamson, JR La segmentation non supervisée basée sur les voxels révèle un paysage d'assemblage précoce de grandes sous-unités de ribosomes bactériens (2022) bioRiv. DOI: https://doi.org/10.1101/2022.11.09.515851

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La biogenèse des ribosomes est un processus complexe mais efficace chez les bactéries à croissance rapide. L'assemblage d'un ribosome 70S fonctionnel prend environ 2 minutes et implique la participation de 3 ARNr, 50 protéines r et des dizaines de facteurs d'assemblage. La reconstitution in vitro utilisant différents sous-ensembles de protéines à grande sous-unité (50S, LSU) avec des ARNr, mise au point par le laboratoire de Nierhaus, a permis d'obtenir la carte d'assemblage de Nierhaus, qui illustre la coopérativité et la dépendance pour la liaison des protéines r LSU à l'ARNr 23S. Le repliement sous-jacent de l'ARNr, qui crée les sites de liaison des protéines r, est particulièrement absent de la carte de Nierhaus. De plus, la relation entre la coopérativité observée in vitro et l'assemblage co-transcriptionnel dans les cellules reste à déterminer. Les intermédiaires pré-50S s'accumulent à basse température dans ΔdeaD, une hélicase à boîte DEAD impliquée dans l'assemblage de 50S. Nous avons résolu 21 cartes de densité pré-50S à partir de fractions contenant des intermédiaires par cryo-EM. Dans ces cartes nouvellement résolues, nous avons découvert le plus ancien intermédiaire jamais décrit, constitué du domaine I à l'extrémité 5' de l'ARNr 23S. Afin d'explorer le mécanisme d'assemblage de ces cartes, nous avons développé une nouvelle méthode de segmentation et d'analyse de dépendance des cartes de densité. Dix blocs d'assemblage coopératifs ont été identifiés à partir de la segmentation des cartes, puis organisés en une carte de dépendance des blocs. C'est la première fois que les dépendances entre le repliement des hélices d'ARNr et la liaison aux protéines ribosomiques ont pu être intégrées dans une carte d'assemblage complète. De plus, nous avons montré comment le tunnel de sortie est replié côté solvant, servant d'échafaudage à la maturation de 50S. Grâce à cette nouvelle méthode d'analyse de segmentation, nous avons revisité les ensembles de données précédemment publiés sur la déplétion de bL17 et ΔsrmB. Fait remarquable, les deux autres ensembles de données sont également cohérents avec la dépendance des blocs, ce qui implique une voie d'assemblage précoce unifiée et un paysage de maturation flexible au début de la biogenèse de 50S.

Jóźwik, IK, Li, W., Zhang, DW, Wong, D., Grawenhoff, J., Ballandras-Colas, A., Aiyer, S., Cherepanov, P., Engelman, AN, Lyumkis, D. Transition B vers A dans l'ADN cible lors de l'intégration rétrovirale. (2022) Recherche sur les acides nucléiques. DOI : 10.1093/nar/gkac644

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Harrison, JJEK, Oliveira Passos, D., Bruhn, JF, Bauman, JD, Tuberty, L., DeStefano, JJ, Xavier Ruiz, F., Lyumkis, D., Arnold, E. La structure cryo-EM de la polyprotéine Pol du VIH-1 fournit des informations sur la maturation du virion (2022) Progrès de la science DOI : https://doi.org/10.1126/sciadv.abn9874

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Aiyer, S., Strutzenberg, TS, Bowman, ME, Noel, JP, Lyumkis, D. Collecte de données cryo-EM à particules uniques avec inclinaison de la platine à l'aide de Leginon. (2022) Jupiter.(185) DOI : 10.3791/64136

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Ballandras-Colas, A., Chivukula, V., Gruszka, DT, Shan, Z., Singh, PK, Pye, VE, McLean, RK, Bedwell, GJ, Li, W., Nans, A., Cook, NJ, Fadel, HJ, Poeschla, EM, Griffiths, DJ, Vargas, J., Taylor, IA, Lyumkis, D., Yardimci, H., Engelman, AN, Cherepanov, P. Interactions multivalentes essentielles à la fonction de l'intégrase lentivirale. (2022) Nature Communications. 13(1):2416. DOI: 10.1038/s41467-022-29928-8

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Horton, N., Ghadirian, N., Shan, Z., Lyumkis, D. Mécanisme d'activation de SgrAI via la filamentation enzymatique et mécanisme d'expansion de la spécificité de la séquence d'ADN. (2022) Journal de la FASEB. 36 Suppl 1 : CECI N'EST QU'UN RÉSUMÉ. DOI : 10.1096/fasebj.2022.36.S1.0R839

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Nous décrivons une nouvelle structure CryoEM à 2.7 Å d'une enzyme filamentogène, SgrAI, dans un état de pré-transition capturé juste avant l'attaque nucléophile. Les enzymes filamentogènes sont des enzymes qui forment des structures linéaires, hélicoïdales et même tubulaires pouvant réguler l'activité enzymatique, jouer un rôle dans la signalisation, nucléer des compartiments cellulaires sans membrane à phases séparées, ou remplir d'autres fonctions possibles. SgrAI est une endonucléase d'ADN spécifique de séquence qui joue un rôle dans l'immunité innée bactérienne. La course aux armements phage-hôte est sans doute le plus ancien système coévolutif dans lequel les bactéries développent des systèmes pour se défendre contre l'ADN envahissant, et les phages développent des systèmes pour déjouer les défenses bactériennes. SgrAI forme des filaments avec une symétrie hélicoïdale gauche de quatre copies par tour, qui pourrait en principe s'étendre indéfiniment. La cinétique d'association et de dissociation du filament et les concentrations de SgrAI lié à l'ADN limitent la taille du filament en conditions de laboratoire à 2 à 20 copies d'enzyme, et le nombre de sites de reconnaissance sur le génome d'un phage limite la taille du filament in vivo. La filamentation active la constante de vitesse de clivage de l'ADN de SgrAI de 200 à 1000 XNUMX fois et étend également la spécificité de la séquence d'ADN de SgrAI à quatorze séquences de reconnaissance supplémentaires. Nos travaux antérieurs ont montré les détails de l'architecture filamentaire, les changements conformationnels de l'ADN et des protéines liés, ainsi que la voie cinétique enzymatique complète, y compris les constantes de vitesse microscopiques pour chaque étape. Ces études suggèrent que le mécanisme de régulation inhabituel impliquant la filamentation a évolué chez SgrAI pour maximiser son activité anti-phage tout en protégeant le génome inhabituellement long de son hôte des cassures d'ADN dommageables. Notre nouvelle structure relie le changement conformationnel observé dans SgrAI sous forme filamenteuse à la liaison d'un second cation divalent dans le site actif, ce qui entraîne le taux de clivage de l'ADN activé observé. En combinaison avec une structure cristalline aux rayons X récemment rapportée de l'apo SgrAI, nous proposons des mécanismes d'expansion de la spécificité de la séquence d'ADN lors de la filamentation, impliquant une transition du désordre vers l'ordre, l'énergétique de la structure de l'ADN et les interactions protéine-ADN.

Rabuck-Gibbons, JN, Lyumkis, D., Williamson, JR Exploration quantitative de l'hétérogénéité compositionnelle dans les ensembles de données cryo-EM des intermédiaires d'assemblage des ribosomes. (2022) La structure. DOI : 10.1016/j.str.2021.12.005

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Shan, Z., Ghadirian, N., Lyumkis, D., Horton, Caroline du Nord L'état de pré-transition et les structures Apo de l'enzyme de formation de filaments SgrAI élucident les mécanismes d'activation et la spécificité du substrat. (2022) Journal de chimie biologique.:101760 DOI: 10.1016/j.jbc.2022.101760

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La filamentation enzymatique est un phénomène répandu qui intervient dans la régulation et la fonction des enzymes. Pour l'endonucléase d'ADN spécifique de séquence formant des filaments, SgrAI, le processus de filamentation accélère son activité de clivage de l'ADN et accroît sa spécificité de séquence, permettant ainsi le clivage rapide de nombreuses séquences d'ADN supplémentaires. Ces deux phénomènes – l'accélération du clivage de l'ADN et l'expansion de la spécificité de séquence – sont supposés réguler des processus critiques de l'immunité innée bactérienne. Cependant, les bases mécanistiques sous-jacentes à ces événements restent obscures. Nous décrivons ici deux nouvelles structures de l'enzyme SgrAI qui éclairent sa fonction catalytique. Tout d'abord, nous présentons la structure cryo-EM de SgrAI filamentaire liée à l'ADN du site primaire intact et au Ca résolu à environ 2.5 Å dans le centre catalytique, qui représente le complexe enzyme/ADN piégé avant la réaction de clivage de l'ADN. Cette structure révèle d'importants changements conformationnels qui contribuent au mécanisme catalytique et à la liaison d'un second cation divalent dans le site actif de l'enzyme, ce qui devrait contribuer à l'augmentation de l'activité de clivage de l'ADN de SgrAI à l'état filamentaire. Ensuite, nous présentons une structure cristalline aux rayons X de SgrAI sans ADN (apo) résolue à une résolution de 2.0 Å, qui révèle une boucle désordonnée impliquée dans la reconnaissance de l'ADN. Collectivement, ces multiples nouvelles observations clarifient le mécanisme d'expansion de la spécificité de séquence d'ADN de SgrAI, y compris la lecture indirecte de la structure de l'ADN dépendante de la séquence, les changements dans les interactions protéine-ADN et la transition du désordre à l'ordre d'un élément crucial de reconnaissance de l'ADN.

Passos, DO, Li, M., Craigie, R., Lyumkis, D. Chapitre de livre - Intégrase rétrovirale : structure, mécanisme et inhibition (2021) Les enzymes. 50:249-300. DOI : https://doi.org/10.1016/bs.enz.2021.06.007

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Lyumkis, D. Chapitre du livre : Orientation privilégiée. Comment reconnaître et gérer les effets indésirables. (2021) Cryo-EM à particules uniques de macromolécules biologiques. DOI: 10.1088/978-0-7503-3039-8

Smith, SJ, Zhao, XZ, Passos, DO, Pye, VE, Cherepanov, P., Lyumkis, D., Burke, TR, Hughes, SH Inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 avec des modifications qui affectent leur efficacité contre les mutants de l'intégrase résistants aux médicaments. (2021) ACS Infect Dis. DOI : 10.1021/acsinfecdis.0c00819

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Smith, SJ, Zhao, XZ, Passos, DO, Lyumkis, D., Burke, TR, Hughes, SH Les inhibiteurs du transfert de brin d’intégrase sont des médicaments anti-VIH efficaces. (2021) Virus. 13(2). DOI : 10.3390/v13020205

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Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, PR, Lyumkis, D. Évaluation de la résolution locale et directionnelle des cartes de densité cryo-EM. (2020) Méthodes en biologie moléculaire. 2215:161-187. DOI: 10.1007/978-1-0716-0966-8_8

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Jóźwik, IK, Passos, DO, Lyumkis, D. Biologie structurale des inhibiteurs du transfert de brin de l'intégrase du VIH. (2020) Tendances en sciences pharmacologiques. DOI : 10.1016/j.tips.2020.06.003

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Baldwin, RP, Lyumkis, D. Outils de visualisation et d'analyse de l'échantillonnage de l'espace de Fourier en Cryo-EM. (2020) Progrès en biophysique et biologie moléculaire. DOI : 10.1016/j.pbiomolbio.2020.06.003

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Brugger, C., Zhang, C., Suhanovsky, MM, Kim, DD, Sinclair, AN, Lyumkis, D., Deaconescu, AM Déterminants moléculaires de la translocation de l'ADNdb par le facteur de couplage transcription-réparation et d'évolutivité Mfd. (2020) Nature Communications. 11(1):3740. DOI: 10.1038/s41467-020-17457-1

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Smith, SJ, Zhao, XZ, Passos, DO, Lyumkis, D., Burke, TR, Hughes, SH Inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 actifs contre les mutants de l'intégrase résistants aux médicaments. (2020) Agents antimicrobiens et chimiothérapie. DOI : 10.1128/AAC.00611-20

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Le traitement de première intention actuellement recommandé pour les patients infectés par le VIH-1 est un inhibiteur du transfert de brin de l'intégrase (IN) de deuxième génération (INSTI), soit le dolutégravir (DTG), soit le bictégravir (BIC), en association avec deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI). Le DTG et le BIC inhibent fortement la plupart des mutants IN résistants à l'INSTI sélectionnés par les INSTI de première génération. Il n'a pas été rapporté que le BIC sélectionne une résistance chez les patients naïfs de traitement, et le DTG a sélectionné un petit nombre de virus résistants chez ces patients. Cependant, certains patients porteurs de virus avec des substitutions sélectionnées par les INSTI de première génération ont mal répondu au passage aux traitements à base de DTG, et certains mutants entraînent une diminution considérable de l'activité du DTG et du BIC lors des dosages. Le nouvel INSTI, le cabotégravir (CAB), actuellement en phase d'essais cliniques avancés, s'est révélé capable de sélectionner de nouveaux mutants résistants. Il est donc important de développer de nouveaux INSTI améliorés, efficaces contre tous les mutants résistants connus. Cela nous a conduit à tester nos meilleurs inhibiteurs, en parallèle avec le DTG, le BIC et le CAB, lors d'un test d'infection à cycle unique contre un panel de nouveaux mutants résistants au CAB. Parmi les INSTI testés, le BIC et notre composé ont présenté la plus large efficacité. Tous deux étaient supérieurs au DTG, comme en témoignent les données obtenues avec le mutant IN T66I/L74M/E138K/S147G/Q148R/S230N, sélectionné par le CAB à l'aide d'une souche de laboratoire résistante à l'EVG. Ces résultats soutiennent le développement préclinique et fournissent des informations pouvant être utilisées pour la conception d'INSTI supplémentaires, efficaces contre un large spectre de mutants résistants.

Passos, DO, Li, M., Jóźwik, IK, Zhao, XZ, Santos-Martins, D., Yang, R., Smith, SJ, Jeon, Y., Forli, S., Hughes, SH, Burke, TR, Craigie, R., Lyumkis, D. Base structurelle de la liaison de l'inhibiteur de transfert de brin aux intasomes du VIH. (2020) Science. DOI : 10.1126/science.aay8015

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Rabuck-Gibbons, JN, Popova, AM, Greene, EM, Cervantes, CF, Lyumkis, D., Williamson, JR SrmB sauve les intermédiaires d'assemblage des ribosomes piégés. (2019) Journal de biologie moléculaire. DOI : 10.1016/j.jmb.2019.12.013

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Baldwin, RP, Lyumkis, D. La non-uniformité des distributions de projection atténue la résolution en cryo-EM. (2019) Programme. Biophys. Mol. Biol. DOI : 10.1016/j.pbiomolbio.2019.09.002

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Polley, S., Lyumkis, D., Horton, Caroline du Nord Mécanisme d'activation allostérique induite par la filamentation de l'endonucléase SgrAI. (2019) La structure. 27(10):1497-1507. DOI : 10.1016/j.str.2019.08.001

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Haack, DB, Yan, X., Zhang, C., Hingey, J., Lyumkis, D., Baker, TS, Toor, N. Structures cryo-EM de l'épissage inverse d'un intron du groupe II dans l'ADN. (2019) Téléphone 178(3):612-623.e12. DOI: 10.1016/j.cell.2019.06.035

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Koneru, PC, Francis, AC, Deng, N., Rebensburg, SV, Hoyte, AC, Lindenberger, J., Adu-Ampratwum, D., Larue, RC, Wempe, MF, Engelman, AN, Lyumkis, D., Fuchs, JR, Levy, RM, Melikyan, GB, Kvaratskhelia, M. Les tétramères d'intégrase du VIH-1 sont la cible antivirale des inhibiteurs d'intégrase allostériques à base de pyridine. (2019) Évie. 8. DOI : 10.7554/eLife.46344

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Lyumkis, D. Défis et opportunités dans l’analyse de particules uniques par cryo-EM. (2019) Journal de chimie biologique. DOI : 10.1074/jbc.REV118.005602

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Zhang, C., Cantara, W., Jeon, Y., Musier-Forsyth, K., Grigorieff, N., Lyumkis, D. Analyse de la variabilité locale discrète et de la covariance structurelle dans les assemblages macromoléculaires à l'aide de la cryo-EM et de la classification focalisée. (2018) Ultramicroscopie. DOI : 10.1016/j.ultramic.2018.11.016

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Tan, YZ, Aiyer, S., Mietzsch, M., Hull, JA, McKenna, R., Grieger, J., Samulski, RJ, Baker, TS, Agbandje-McKenna, M., Lyumkis, D. Structure corrigée de la courbure d'Ewald sub-2 Å d'une variante de capside AAV2. (2018) Nature Communications. 9(1):3628. DOI: 10.1038/s41467-018-06076-6

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Zhang, C., Konermann, S., Brideau, NJ, Lotfy, P., Wu, X., Novick, SJ, Strutzenberg, T., Griffin, PR, Hsu, PD, Lyumkis, D. Base structurelle de l'activité ribonucléase guidée par l'ARN de CRISPR-Cas13d. [Pubmed] (2018) Téléphone 175(1):212-223.e17. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.001

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Tan, YZ, Baldwin, PR, Davis, JH, Williamson, JR, Potter, CS, Carragher, B., Lyumkis, D. Aborder l'orientation préférée des échantillons dans la cryo-EM à particules uniques par inclinaison. (2017) Méthodes de la nature. 14(8):793-796. DOI : 10.1038/nmeth.4347

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Ozorowski, G., Pallesen, J., de Val, N., Lyumkis, D., Cottrell, CA, Torres, JL, Copps, J., Stanfield, RL, Cupo, A., Pugach, P., Moore, JP, Wilson, IA, Ward, AB Les structures ouvertes et fermées révèlent l'allostérie et la souplesse de la pointe de l'enveloppe du VIH-1. (2017) Nature. 547(7663):360-363. DOI : 10.1038/nature23010

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Pour de nombreux virus enveloppés, la liaison à un ou plusieurs récepteurs sur une cellule hôte constitue la première étape d'une série d'événements aboutissant à la fusion avec la membrane de la cellule hôte et au transfert du matériel génétique nécessaire à la réplication. Le trimère de la glycoprotéine d'enveloppe (Env) à la surface du VIH est responsable de la liaison et de la fusion du récepteur. Bien qu'Env puisse tolérer un degré élevé de mutation dans cinq régions variables (V1-V5), ainsi que sur les sites de glycosylation N-liés qui représentent environ la moitié de la masse d'Env, les sites fonctionnels de reconnaissance du récepteur CD4 et du co-récepteur CXCR4/CCR5 sont conservés et essentiels à l'aptitude virale. Les trimères d'Env SOSIP solubles sont des imitations structurales et antigéniques de l'Env native, présentée en surface avant la fusion, et sont la cible d'anticorps largement neutralisants. Ils constituent donc des immunogènes intéressants pour le développement de vaccins. Nous présentons ici des structures obtenues par cryomicroscopie électronique à haute résolution de trimères d'enveloppe SOSIP B41 de sous-type B en complexe avec CD4 et l'anticorps 17b, ou avec l'anticorps b12, à des résolutions respectives de 3.7 Å et 3.6 Å. Nous les comparons aux reconstructions obtenues par cryomicroscopie électronique de trimères d'enveloppe SOSIP B41 sans ligand ou en complexe avec CD4 ou l'anticorps PGV4, site de liaison à CD04, à des résolutions respectives de 5.6 Å, 5.2 Å et 7.4 Å. Par conséquent, nous présentons la description la plus complète à ce jour, à notre connaissance, de l'intermédiaire induit par CD4-17b et fournissons les bases moléculaires du changement conformationnel induit par la liaison au récepteur nécessaire à l'entrée du VIH-1 dans les cellules hôtes. CD4 et b12 induisent tous deux d'importants réarrangements conformationnels, jusqu'alors non caractérisés, dans les sous-unités gp41, et le peptide de fusion est enfoui dans une poche nouvellement formée. Ces structures fournissent des informations clés sur la fonction biologique de la machine de fusion virale de type I du VIH-1, ainsi que de nouveaux modèles pour la conception d'inhibiteurs.

Passos, DO, Li, M., Yang, R., Rebensburg, SV, Ghirlando, R., Jeon, Y., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Craigie, R., Lyumkis, D. Structures cryo-EM et modèle atomique du complexe de transfert de brin du VIH-1 dans l'intasome. (2017) Science. 355(6320):89-92. DOI : 10.1126/science.aah5163

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Davis, JH, Tan, YZ, Carragher, B., Potter, CS, Lyumkis, D., Williamson, JR Assemblage modulaire de la grande sous-unité ribosomique bactérienne. (2016) Téléphone 167(6):1610-1622.e15. DOI: 10.1016/j.cell.2016.11.020

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Polley, S., Passos, DO, Huang, DB, Mulero, MC, Mazumder, A., Biswas, T., Verma, IM, Lyumkis, D., Ghosh, G. Base structurelle de l'activation de IKK1/α. (2016) Rapports de cellule 17(8):1907-1914. DOI : 10.1016/j.celrep.2016.10.067

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Ballandras-Colas, A., Brown, M., Cook, NJ, Dewdney, TG, Demeler, B., Cherepanov, P., Lyumkis, D., Engelman, AN La cryo-EM révèle une nouvelle structure d'intégrase octamérique pour la fonction de l'intasome bêta-rétroviral. (2016) Nature. 530(7590):358-61. DOI : 10.1038/nature16955

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L'intégrase rétrovirale catalyse l'intégration de l'ADN viral dans l'ADN cible de l'hôte, étape essentielle du cycle de vie de tous les rétrovirus. La caractérisation structurale antérieure des complexes intégrase-ADN viral, ou intasomes, du prototype spumavirus spumeux a révélé la présence d'un tétramère d'intégrase fonctionnel, et il est généralement admis que les intasomes dérivés d'autres genres rétroviraux utilisent l'intégrase tétramérique. Cependant, les intasomes des orthorétrovirus, qui comprennent toutes les espèces pathogènes connues, n'ont pas été caractérisés structurellement. Ici, par cryomicroscopie électronique à particules uniques et cristallographie aux rayons X, nous déterminons une architecture octamérique inattendue de l'intégrase de l'intasome du virus de la tumeur mammaire de la souris bêta-rétrovirus. La structure est composée de deux dimères d'intégrase centrale, qui interagissent avec les extrémités de l'ADN viral et imitent structurellement le tétramère d'intégrase du prototype de virus spumeux, et de deux dimères d'intégrase flanquants qui engagent la structure centrale via leurs domaines carboxy-terminaux d'intégrase. Contrairement à l'idée reçue selon laquelle les composants tétramériques de l'intégrase suffisent à catalyser l'intégration, les dimères d'intégrase flanquants étaient nécessaires à l'activité intégrase du virus des tumeurs mammaires de la souris. L'octamère d'intégrase résout un problème pour les bêta-rétrovirus comme pour les alpha-rétrovirus en fournissant au cœur de l'intasome des domaines carboxy-terminaux essentiels qui ne peuvent être fournis en cis en raison de régions de liaison domaine catalytique central-domaine carboxy-terminal restrictives au cours de l'évolution. L'architecture octamérique de l'intasome du virus des tumeurs mammaires de la souris apporte de nouvelles perspectives sur les bases structurelles de l'intégration de l'ADN rétroviral.

Passos, DO, Lyumkis, D. Analyse cryoEM de particules uniques à une résolution quasi atomique à partir de plusieurs milliers de sous-unités asymétriques. (2015) Journal de biologie structurale. 192(2):235-44. DOI : 10.1016/j.jsb.2015.10.002

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Lee, JH, de Val, N., Lyumkis, D., Ward, AB Construction et raffinement d'un modèle de protéine d'enveloppe du VIH-1 glycosylée nativement par microscopie cryoélectronique à haute résolution. (2015) La structure. 23(10):1943-51. DOI : 10.1016/j.str.2015.07.020

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Lyumkis, D., Oliveira dos Passos, D., Tahara, EB, Webb, K., Bennett, EJ, Vinterbo, S., Potter, CS, Carragher, B., Joazeiro, CA Base structurelle de la surveillance translationnelle par le complexe de contrôle de la qualité des protéines associées à la grande sous-unité ribosomique. (2014) Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique. 111(45):15981-6. DOI : 10.1073/pnas.1413882111

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Sashital, DG, Greeman, Californie, Lyumkis, D., Potter, CS, Carragher, B., Williamson, JR Une analyse combinée de spectrométrie de masse quantitative et de microscopie électronique de l'assemblage de la sous-unité ribosomique 30S dans E. coli. (2014) Évie. 3. DOI : 10.7554/eLife.04491

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Lyumkis, D., Julien, JP, de Val, N., Cupo, A., Potter, CS, Klasse, PJ, Burton, DR, Sanders, RW, Moore, JP, Carragher, B., Wilson, IA, Ward, AB Structure cryo-EM d'un trimère d'enveloppe du VIH-1 clivé soluble entièrement glycosylé. (2013) Science. 342(6165):1484-90. DOI : 10.1126/science.1245627

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Julien, JP, Cupo, A., Sok, D., Stanfield, RL, Lyumkis, D., Deller, MC, Klasse, PJ, Burton, DR, Sanders, RW, Moore, JP, Ward, AB, Wilson, IA Structure cristalline d'un trimère d'enveloppe soluble du VIH-1 clivé. (2013) Science. 342(6165):1477-83. DOI : 10.1126/science.1245625

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Lyumkis, D., Vinterbo, S., Potter, CS, Carragher, B. Optimod – une approche automatisée pour la construction et l’optimisation de modèles initiaux pour la microscopie électronique à particules uniques. (2013) Journal de biologie structurale. 184(3):417-26. DOI : 10.1016/j.jsb.2013.10.009

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La cryomicroscopie électronique à particules uniques est désormais une technique bien établie pour la caractérisation structurale des grandes macromolécules et des complexes macromoléculaires. Les données brutes sont très bruitées et consistent en des projections bidimensionnelles, à partir desquelles l'objet biologique 3D doit être reconstruit. L'objet 3D dépend de la connaissance des orientations angulaires appropriées attribuées aux images de projection 2D. De nombreux algorithmes ont été développés pour déterminer les orientations angulaires relatives entre les images 2D, mais la transition de la 2D à la 3D reste complexe et peut entraîner des résultats erronés et contradictoires. Nous décrivons ici une procédure automatisée générale, appelée OptiMod, pour la reconstruction et l'optimisation de modèles 3D à l'aide de méthodologies de lignes communes. OptiMod approxime les angles d'orientation et reconstruit des cartes indépendantes à partir des moyennes de classes 2D. Il itère ensuite la procédure, en considérant chaque carte comme une solution brute devant être comparée à d'autres résultats possibles. Nous intégrons des procédures d'alignement 3D, de clustering et d'affinement pour optimiser chaque carte, ainsi que des mesures de score standard pour faciliter la sélection du modèle optimal. Nous montrons également que les données de paires d'inclinaisons à petit angle peuvent être incluses comme mesure de score pour améliorer la sélection du modèle initial optimal et fournir un contrôle de validation. L'approche globale est démontrée à l'aide de deux ensembles de données expérimentales de cryo-EM : le ribosome 80S, qui représente un cas relativement simple de reconstruction ab initio, et le complexe Tf-TfR, qui représente un cas complexe dans la mesure où il a déjà été démontré qu'il fournissait plusieurs solutions également plausibles au problème du modèle initial.

Lyumkis, D., Talley, H., Stewart, A., Shah, S., Park, CK, Tama, F., Potter, CS, Carragher, B., Horton, NC Régulation allostérique du clivage de l'ADN et spécificité de séquence par oligomérisation continue. (2013) La structure. 21(10):1848-58. DOI : 10.1016/j.str.2013.08.012

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Lyumkis, D., Brilot, AF, Theobald, DL, Grigorieff, N. Classification basée sur la vraisemblance des images cryo-EM à l'aide de FREALIGN. (2013) Journal de biologie structurale. 183(3):377-388. DOI : 10.1016/j.jsb.2013.07.005

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Yoshioka, C., Lyumkis, D., Carragher, B., Potter, CS Maskiton : Classification interactive, basée sur le Web, d'images de microscopie électronique à particules uniques. (2013) Journal de biologie structurale. 182(2):155-63. DOI : 10.1016/j.jsb.2013.02.007

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Lyumkis, D., Doamekpor, SK, Bengtson, MH, Lee, JW, Toro, TB, Petroski, MD, Lima, CD, Potter, CS, Carragher, B., Joazeiro, CA L'EM à particule unique révèle une variabilité conformationnelle importante de la ligase Ltn1 E3. (2013) Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique. 110(5):1702-7. DOI : 10.1073/pnas.1210041110

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Campbell, MG, Cheng, A., Brilot, AF, Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, SC, Potter, CS, Carragher, B., Grigorieff, N. Les films de particules intégrées dans la glace améliorent la résolution en cryomicroscopie électronique. (2012) La structure. 20(11):1823-8. DOI : 10.1016/j.str.2012.08.026

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Milazzo, AC, Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, MH, Xuong, NH, Carragher, B., Potter, CS Évaluation initiale d'un détecteur à dispositif de détection directe pour la cryo-microscopie électronique à particules uniques. (2011) Journal de biologie structurale. 176(3):404-8. DOI : 10.1016/j.jsb.2011.09.002

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Voss, NR, Lyumkis, D., Cheng, A., Lau, PW, Mulder, A., Lander, GC, Brignole, EJ, Fellmann, D., Irving, C., Jacovetty, EL, Leung, A., Pulokas, J., Quispe, JD, Winkler, H., Yoshioka, C., Carragher, B., Potter, CS Une boîte à outils pour les reconstructions 3D ab initio en microscopie électronique à particules uniques. (2010) Journal de biologie structurale. 169(3):389-98. DOI : 10.1016/j.jsb.2009.12.005

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Lyumkis, D., Moeller, A., Cheng, A., Herold, A., Hou, E., Irving, C., Jacovetty, EL, Lau, PW, Mulder, AM, Pulokas, J., Quispe, JD, Voss, NR, Potter, CS, Carragher, B. Automatisation en microscopie électronique à particules uniques reliant les pièces. (2010) Méth. Enzymol. 483:291-338. DOI: 10.1016/S0076-6879(10)83015-0

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Tout au long de l'histoire de la microscopie électronique à particules (ME), les technologies automatisées ont connu des degrés d'importance et de développement variables, généralement en fonction des exigences contemporaines du domaine. Nous sommes actuellement confrontés à des dispositifs de plus en plus sophistiqués pour la préparation des échantillons, à une augmentation considérable de la taille des ensembles de données collectées, à des algorithmes complets pour le traitement des images, à des outils sophistiqués d'évaluation de la qualité et à un afflux de scientifiques extérieurs au domaine, parfois dépourvus des compétences de microscopistes expérimentés. Cette situation rend les techniques automatisées très demandées. Dans ce chapitre, nous proposons une définition générique et analysons certaines des avancées les plus importantes en matière d'approches automatisées pour la préparation des échantillons, la manipulation des grilles, le criblage robotisé, l'étalonnage des microscopes, l'acquisition de données, le traitement des images et l'infrastructure informatique. Chaque section décrit le problème général, puis fournit des exemples de solutions automatisées, en mettant en avant les logiciels de traitement disponibles et, parfois, en décrivant l'approche spécifique du National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM). Nous comparons les procédures manuelles plus courantes aux approches automatisées, en soulignant les avancées ainsi que les limites actuelles. Enfin, nous spéculons sur les orientations et les améliorations futures des technologies automatisées. Notre objectif général est de présenter l'automatisation comme bien plus qu'un simple outil permettant de gagner du temps. Nous souhaitons plutôt démontrer qu'elle est une stratégie complète et polyvalente, capable de fournir des informations biologiques à une échelle sans précédent, dépassant les possibilités offertes par les approches manuelles classiques.

Lander, GC, Stagg, SM, Voss, NR, Cheng, A., Fellmann, D., Pulokas, J., Yoshioka, C., Irving, C., Mulder, A., Lau, PW, Lyumkis, D., Potter, CS, Carragher, B. Appion : un pipeline intégré, piloté par base de données, pour faciliter le traitement des images EM. (2009) Journal de biologie structurale. 166(1):95-102. DOI : 10.1016/j.jsb.2009.01.002

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Dmitry Lyumkis, PhD

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