Núcleo de Secuenciación de Nueva Generación

Todos los envíos de muestras deben ir acompañados de los formularios de envío correspondientes.

1. Descargue los formularios de envío apropiados a continuación y complételos completamente de acuerdo con las instrucciones en la primera hoja.
   • Illumina BIBLIOTECA Y FORMULARIO DE SECUENCIACIÓN: muestra de ARN y ADN para preparación y secuenciación de bibliotecas de Illumina
   • Illumina SOLAMENTE FORMA DE SECUENCIACIÓN: Entregar tu biblioteca para secuenciación HiSeq o NextSeq
   • FORMULARIO DE ENVÍO DE MUESTRA DE UNA SOLA CELDA 10X
   • PacBio_Sequel II BIBLIOTECA Y FORMULARIO DE SECUENCIACIÓN
   • Formulario Nanostring nCounter
2. Envíe por correo electrónico los formularios de muestra completos a ngs@salk.edu.
3. Hora de entrega de la muestra: Martes y jueves de 10:00 a 12:00 (excepto festivos)

1. Requisitos de muestras de ARN/ADN para preparaciones de bibliotecas de Illumina
   • El ADN y el ARN de entrada se cuantifican mediante un método fluorométrico (p. ej., Qubit, PicoGreen).
   • Proporcione una lectura de nanogotas si no tiene acceso a un método fluorométrico.
   • Todas las muestras de ARN deben estar libres de ADN/Todas las muestras de ADN deben estar libres de ARN.
     • Illumina BIBLIOTECA Y FORMULARIO DE SECUENCIACIÓN: Muestras de ARN y ADN para preparación y secuenciación de bibliotecas de Illumina
     • Illumina SOLAMENTE FORMA DE SECUENCIACIÓN: Enviar bibliotecas preparadas por el usuario Secuenciación de Illumina

 

Tipo de biblioteca	Concentración (determinada por Qubit)	Importe total de entrada	Quality	Comentarios
ARNm trenzado (seleccionado por PolyA)	ARN total 50-200 ng/μl	>1 µg	Rin > 8 A260/280=~2.0 A260/230=2.0-2.2	resuspender en libre de ARNasa agua
ARN total (ARN ribosomal y mitocondrial agotado)	ARN total 50-200 ng/μl	>1 µg	Rin > 8 A260/280=~2.0 A260/230=2.0-2.2	resuspender en libre de ARNasa agua
ARN de entrada ultrabaja	0.1-10 ng		Rin > 8 A260/280=~2.0 A260/230=2.0-2.2	resuspender en libre de ARNasa agua
Genoma completo (sin PCR de ADN de Illumina)	20-500 /ul	>500ng	A260/280=1.8-2.0 A260/230=2.0-2.2	Resuspender en EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0)
Genoma pequeño (> 5 Mb), Amplicon (> 150 pb) (Preparación de ADN de Illumina nombre antiguo Nextera flex)	5-50 ng/ul	>100ng	A260/280=1.8-2.0 A260/230=2.0-2.2	Resuspender en EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0)
Genoma pequeño (<5 Mb), amplicón (>300 pb) (Nextera XT)	0.2-1 ng/ul	>2ng	A260/280=1.8-2.0 A260/230=2.0-2.2	Resuspender en EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0)
Chip, ADN fragmentado	0.2-5 ng/ul	10ng	A260/280=1.8-2.0 A260/230=2.0-2.2	Resuspender en EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0)

 

2. Presentación de la biblioteca preparada por el usuario y requisitos para la secuenciación de Illumina
   Las bibliotecas agrupadas deben cuantificarse mediante un método fluorométrico (p. ej., Qubit, PicoGreen) y enviarse con trazas de TapeStation (o equivalente). Envíe sus bibliotecas agrupadas en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml claramente etiquetados (preferiblemente de baja unión). Cuantificamos todos los grupos de bibliotecas antes de cargarlos en los secuenciadores.

 

Biblioteca preparada por el usuario	Concentración (determinada por Qubit)	Volumen	Tampón preferido
SiguienteSeq, MiniSeq	5 nM (aprox. 0.5~1.0 ng/µl)	30 µl	EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0) o EB+0.1% Tween20
Celda de flujo NovaSeq S4	5 nM (aprox. 0.5~1.0 ng/µl)	300 µl	EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0) o EB+0.1% Tween20
Celda de flujo NovaSeq SP, S1, S2	5 nM (aprox. 0.5~1.0 ng/µl)	150 µl	EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0)

Ejemplo de requisitos de envío para la preparación de la plantilla de campana SMRT
Para HMW gDNA, la calidad del ADN afectará la biblioteca resultante y los resultados de la secuenciación. Es imperativo que el ADN utilizado sea de alta calidad y en cantidad suficiente ya que no hay etapa de amplificación.
 

Aplicación	Entrada	Entrada total	Concentración (determinada por Qubit)	QC	Comentarios
ISO-Seq (RNA-Seq de transcripción de longitud completa)	ARN total	>700ng	50-200 ng/μl	A260/280=1.8-2.0 A260/230=2.0-2.2 RIN > 8	Resuspender en agua libre de ARNasa
	ADNc	>1 µg	50-200 ng/μl	Perfil de cDNA (Tapestaion o Bioanalyzer)	Resuspender en EB o EDTA TE bajo
WGS, ~10kb, CLR	ADNg de APM	>5 µg	50-200 ng/μl	A260/280=1.8-2.0 A260/230=2.0-2.2 Imágenes PFGE para ADNg	Resuspender en EB o EDTA TE bajo **El ADN debe ser de alta calidad y en cantidad suficiente ya que no hay un paso de amplificación.
WGS, >15 kb, CLR		>15 µg	50-200 ng/μl
WGS, >30 kb, CLR		>25 µg	25-200 ng/μl
Alta fidelidad (HiFi), 10-15 kb, CCS		>15 µg	100-500 ng/μl
Productos de PCR purificados/ amplicones multiplexados	Tamaño del amplicón	Entrada de masa de ADN por conjunto de amplicones	Conc requerida por grupo de amplicones	Distribución de Tamaños (Tapestaion o Bioanalyzer)	Resuspender en EB o EDTA TE bajo
	250-500 pb	1 ug	15-100 ng/μl
	500-1000 pb	1 ug	15-100 ng/μl
	1-3kb	2 ug	30-200 ng/μl
	3-10kb	4 ug	50-400 ng/μl

Los equipos enumerados supervisados ​​por NGS Core están disponibles para la comunidad de Salk. Para mantener la longevidad y el funcionamiento adecuado de todo el equipo, tenga la capacitación adecuada antes de usarlo y siga las instrucciones con mucho cuidado. Todos los laboratorios que utilicen equipos de las instalaciones deben tener su personal capacitado. Esto nos ayudará a monitorear el uso de la máquina y garantizar que todos tengan la misma base de conocimientos. Además, asegúrese de limpiar después de su uso para los próximos usuarios y devuelva cualquier equipo principal a donde pertenece.  

• Solución de una sola célula de genómica 10X (requiere reserva)
• Sistema Q3 y Q5 QuantStudio RT-qPCR (requiere reserva)
• Bioanalizador Agilant 2100
• TapeStation 2200 de Agilant
• Fluorómetro Qubit 2.0
• Covaris™ M220 Ultrasónico enfocado™
• Sonicador de sonda EpiShear™
• Sistema de PCR digital de gotas Bio-Rad QX200
• TECAN Infinito^® Lector 200PRO
• Impresora 3D (Requiere Reserva)

Reserva de instrumentos https://secure8.ideaelan.com/secure/public/applogin.aspx

• Puede iniciar sesión con la credencial de su cuenta de AD.
• Seleccione "Programar instrumentos"
• Seleccione Instalación (esquina superior derecha) → Secuenciación de próxima generación
• Por favor, lea las reglas de reserva en Infinity

Guía de servicio

1. Inocule colonias en hasta 5 ml de LB o TB con el antibiótico apropiado en tubos Falcon de 14 ml (BD 352059). Cierre la tapa sin apretar. Etiquete los tubos con la primera y la última inicial seguidas de una identificación numérica (Ejemplo AB01, AB02, etc.) Coloque las muestras en la primera ranura disponible numéricamente en el agitador de 37 grados en el cuarto piso del edificio sur, directamente sobre el núcleo NGS. Las muestras se procesarán en el orden numérico de las ranuras.
   Nota: Los tubos Falcon de 14 ml son los únicos tubos que aceptará el robot. Las muestras enviadas en todos los demás tipos de tubos no serán procesadas.
2. Llene la hoja de cálculo en la parte superior de la coctelera. Asegúrese de que el ID de la ranura coincida con el ID de la hoja de cálculo.
3. Para minimizar el error de manipulación y facilitar la distribución del ADN, el número de muestras enviadas debe ser múltiplo de 8. Por ejemplo: 8, 16, 24, etc. El número mínimo de muestras es 8. Se le cobrará por el costo de 8 muestras incluso si envía solo 6 muestras.
4. Las muestras se realizarán antes del mediodía del día siguiente.
   Nota: Para que sus muestras se procesen al día siguiente, debe cultivar sus cultivos utilizando el agitador designado por core.
5. Se le notificará por correo electrónico cuando sus muestras estén listas para ser recogidas. Recoja sus muestras antes de las 3:00 p. m. de ese día.
   Nota: La instalación central de genómica funcional no será responsable de las muestras que no se recojan en este momento.
6. Para aquellos de ustedes que tienen 96 muestras en total, el núcleo les proporcionará un bloque de 96 pocillos profundos para la inoculación. Esto le ahorrará el tiempo y el esfuerzo de inocular en tubos.