Pubblicazioni - Salk Institute for Biological Studies

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Re, RN, La Clair, JJ, Noel, JP, Burkart, MD Chiarimento del meccanismo di allungamento iterativo in una polichetide sintasi di tipo III. (2025) Giornale della Società chimica americana. DOI: 10.1021 / jacs.5c05635

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Chen, A., Re, RN, Davis, TD, Tran, K., Moriuchi, YW, Wu, S., La Clair, JJ, Louie, GV, Bowman, ME, Clarke, DJ, Mackay, CL, Campopiano, DJ, Noel, JP, Burkart, MD Visualizzazione dell'interfaccia tra biotina e biosintesi degli acidi grassi tramite sonde SuFEx. (2024) Giornale della Società chimica americana. DOI: 10.1021 / jacs.3c10181

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Aiyer, S., Baldwin, PR, Tan, SM, Shan, Z., Oh, J., Mehrani, A., Bowman, ME, Louie, G., Passos, DO, Đorđević-Marquardt, S., Mietzsch, M., Hull, JA, Hoshika, S., Barad, BA, Grotjahn, DA, McKenna, R., Agbandje-McKenna, M., Benner, SA, Noel, JAP, Wang, D., Tan, YZ, Lyumkis, D. Superamento dell'attenuazione della risoluzione durante la raccolta di dati crio-EM inclinati. (2024) Nature Communications. 15(1):389. DOI: 10.1038/s41467-023-44555-7

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Nartey, CM, Koo, HJ, Laurendon, C., Shaik, HZ, O'maille, P., Noel, JP, Morcos, F. Le informazioni coevolutive catturano le funzioni catalitiche e rivelano ruoli divergenti delle connessioni interdominio della terpene sintasi. (2024) Biochimica. DOI: 10.1021/acs.biochem.3c00578

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Dedurre le cause storiche e biofisiche della diversità all'interno delle famiglie proteiche è un enigma complesso. Una chiave per risolvere questo problema è caratterizzare la topografia accidentata dei paesaggi adattivi sequenza-funzione. Utilizzando i dati biochimici di una libreria combinatoria di 2 = 512 mutanti della 5-aristolochene sintasi del tabacco (TEAS) ingegnerizzati per produrre il principale prodotto nativo della premnaspirodiene sintasi (HPS) del giusquiamo egiziano e una libreria complementare di 512 mutanti HPS, affrontiamo la questione di come venga controllata la specificità del prodotto. Questi set di dati rivelano che la HPS è molto più robusta e resistente alle mutazioni rispetto alla TEAS, dove la maggior parte dei mutanti è promiscua. Combiniamo inoltre i dati sperimentali con un modello hamiltoniano di Potts di sequenza e un'analisi di accoppiamento diretto per quantificare l'idoneità dei mutanti. I nostri risultati dimostrano che l'hamiltoniana cattura la variazione nei prodotti in uscita in entrambe le librerie, raggruppa i membri nativi della famiglia in base alle loro specificità di substrato ed espone i ruoli catalitici divergenti degli accoppiamenti tra i domini catalitico e non catalitico di TEAS rispetto a HPS. Nello specifico, abbiamo scoperto che il ruolo delle connettività interdominio nella specificazione dei prodotti in uscita è più importante in TEAS rispetto alle connettività all'interno del dominio catalitico. Nonostante siano identiche al 75%, questa proprietà non è condivisa da HPS, dove le connettività all'interno del dominio catalitico sono più importanti per la specificità. Risolvendo la struttura cristallina a raggi X di HPS, abbiamo valutato le basi strutturali per le loro differenze di rete interdominio. Infine, abbiamo calcolato le entropie di Shannon del profilo di prodotto delle due librerie, il che dimostra che anche le connettività sito-sito svolgono ruoli divergenti nell'accuratezza catalitica.

Xie, L., Bowman, ME, Louie, GV, Zhang, C., Ardejani, MS, Huang, X., Chu, Q., Donaldson, CJ, Vaughan, JM, Shan, H., Powers, ET, Kelly, JW, Lyumkis, D., Noel, JP, Saghatelian, A. Biochimica e interazioni proteiche della microproteina CYREN. (2023) Biochimica. DOI: 10.1021/acs.biochem.3c00397

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Jiang, Z., Chen, A., Chen, J., Sekhon, A., Louie, GV, Noel, JP, La Clair, JJ, Burkart, MD La cerulenina mascherata consente un crosslink proteico selettivo a doppio sito. (2023) Scienze chimiche 14(39):10925-10933. DOI: 10.1039/d3sc02864j

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Chen, A., Mindrebo, JT, Davis, TD, Kim, WE, Katsuyama, Y., Jiang, Z., Ohnishi, Y., Noel, JP, Burkart, MD Le sonde di cross-linking basate sul meccanismo catturano la chetosintasi FabB di Escherichia coli in stati catalitici conformazionalmente distinti. (2022) Acta Crystallogr D Struct Biol. 78(Pt 9):1171-1179. DOI: 10.1107/S2059798322007434

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Chen, PY, Adak, S., Chekan, JR, Liscombe, DK, Miyanaga, A., Bernhardt, P., Diethelm, S., Fielding, EN, George, JH, Miles, ZD, Murray, LAM, Steele, TS, Winter, JM, Noel, JP, Moore, BS Basi strutturali degli enzimi stereospecifici della famiglia delle aloperossidasi dipendenti dal vanadio nella biosintesi della napiradiomicina. (2022) Biochimica. DOI: 10.1021/acs.biochem.2c00338

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Le aloperossidasi vanadio-dipendenti (VHPO) batteriche differiscono dalle loro controparti presenti in funghi, macroalghe e altri batteri catalizzando reazioni organoalogenanti con rigoroso controllo regiochimico e stereochimico. Mentre questo gruppo di enzimi utilizza collettivamente il perossido di idrogeno per ossidare gli alogenuri e incorporarli in molecole organiche ricche di elettroni, il meccanismo di trasferimento controllato di ioni cloronio altamente reattivi nella biosintesi degli antibiotici napiradiomicina e meroclorina distingue le cloroperossidasi vanadio-dipendenti. Qui riportiamo le strutture cristalline ad alta risoluzione di due membri omologhi della famiglia VHPO associati alla biosintesi della napiradiomicina, NapH1 e NapH3, che catalizzano reazioni chimiche distintive nella produzione di prodotti naturali meroterpenoidi. Le strutture, combinate con studi di mutagenesi sito-specifica e spettrometria di massa di proteine intatte, hanno fornito un modello meccanicistico per le reazioni di clorurazione asimmetrica di alcheni e areni catalizzate da NapH1 e per l'attività isomerasica catalizzata da NapH3. Un residuo di lisina chiave in NapH1, situato tra il vanadato coordinato e la presunta tasca di legame al substrato, si è dimostrato essenziale per la catalisi. Questa osservazione ha suggerito il coinvolgimento dell'ε-NH, probabilmente attraverso la formazione di una clorammina transitoria, come specie clorurante, in modo simile a quanto proposto nelle alogenasi flavina-dipendenti strutturalmente distinte. Inaspettatamente, NapH3 viene modificato post-traduzionalmente dalla fosforilazione di un sito attivo His (τ-pHis), coerentemente con la sua attività isomerasica α-idrossichetone indipendente dall'alogenazione, riadattata. Questi studi strutturali approfondiscono la nostra comprensione dei fondamenti meccanicistici degli enzimi VHPO e della loro evoluzione come biocatalizzatori enantioselettivi.

Aiyer, S., Strutzenberg, TS, Bowman, ME, Noel, JP, Lyumkis, D. Raccolta dati crio-EM di singole particelle con inclinazione del palco mediante Leginon. (2022) GioVE.(185) DOI: 10.3791/64136

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Mindrebo, JT, Chen, A., Kim, WE, Re, RN, Davis, TD, Noel, JP, Burkart, MD Analisi strutturale e meccanicistica del meccanismo di controllo delle chetosintasi in allungamento. (2021) ACS Catal. 11(12):6787-6799. DOI: 10.1021/acscatal.1c00745

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Le chetosintasi (KS) catalizzano le reazioni di formazione di legami carbonio-carbonio nelle sintasi degli acidi grassi (FAS) e nelle sintasi dei polichetidi (PKS). Le KS utilizzano un meccanismo cinetico a ping-pong in due fasi per eseguire una condensazione tio-Claisen decarbossilativa complessiva che può essere scomposta nelle reazioni di transacilazione e condensazione. In entrambe le fasi, una proteina trasportatrice di acili (ACP) trasporta i substrati legati al tioestere ai siti attivi delle KS. Pertanto, le interazioni proteina-proteina (PPI) e gli eventi di riconoscimento del substrato mediati dalle KS sono necessari per la catalisi. Recentemente, le strutture cristalline delle FAS di tipo II in allungamento (KS), FabF e FabB, in complesso con ACP, AcpP, hanno rivelato stati conformazionali distinti di due loop delle KS nel sito attivo. È stato proposto che questi loop operino tramite un meccanismo di gating per coordinare il riconoscimento e il rilascio del substrato, seguito dalla catalisi. In questo articolo analizziamo questo meccanismo di gating proposto risolvendo due ulteriori strutture ad alta risoluzione di complessi AcpP-FabF coinvolti dal substrato, una delle quali fornisce la conformazione mancante AcpP-FabF gate-closed. Interazioni chiaramente definite di uno di questi loop del sito attivo con AcpP sono presenti sia in conformazione aperta che chiusa, suggerendo che il legame di AcpP inneschi o stabilizzi le transizioni di gating, implicando ulteriormente i PPI nella catalisi dipendente dalla proteina carrier. Dimostriamo funzionalmente l'importanza del gating nella reazione di condensazione complessiva del KS e forniamo prove sperimentali del suo ruolo nella reazione di transacilazione. Inoltre, valutiamo l'importanza catalitica di questi loop utilizzando la mutagenesi a scansione di alanina e studiamo anche costrutti FabF chimerici che trasportano elementi presenti nei domini KS dei PKS di tipo I. Questi risultati ampliano la nostra comprensione del meccanismo del KS, il che fa avanzare i futuri sforzi ingegneristici sia nei FAS che nei PKS evolutivamente correlati.

Thomas, ST, Shin, Y., La Clair, JJ, Noel, JP Estrazione e stoccaggio di CO2 tramite impianti sotto forma di SiC. (2021) RSC Avv. 11(26):15512-15518. DOI: 10.1039/d1ra00954k

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Mindrebo, JT, Misson, LE, Johnson, C., Noel, JP, Burkart, MD Attività di mappatura della proteina trasportatrice di acili: allungamento dell'interazione chetosintasi nella biosintesi degli acidi grassi. (2020) Biochimica. DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00605

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Le chetosintasi allunganti (KS) catalizzano le reazioni di formazione di legami carbonio-carbonio durante la fase di attivazione di ogni ciclo di estensione di catena sia nelle sintasi degli acidi grassi (FAS) che nelle sintasi dei polichetidi (PKS). Una piccola proteina trasportatrice di acili (ACP) ad α-elica trasporta gli intermedi acilici grassi tra i siti attivi dell'enzima. Per svolgere questo compito, l'ACP si basa su una serie di interazioni dinamiche con molteplici enzimi partner di FAS e vie metaboliche FAS-dipendenti associate. Recenti strutture dell'ACP di FAS, AcpP, in complessi covalenti con i suoi due KS allunganti affini, FabF e FabB, forniscono dettagli ad alta risoluzione di queste interfacce, ma non è stata ancora intrapresa un'analisi sistematica delle specifiche interazioni interfacciali responsabili della stabilizzazione di questi complessi. In questo articolo, utilizziamo la mutagenesi sito-specifica con analisi sia di attività che di attività per valutare quantitativamente queste superfici di contatto tra AcpP e FabF. Delineiamo l'interfaccia FabF in tre regioni interagenti e dimostriamo gli effetti di mutanti puntiformi, doppi mutanti e varianti di delezione di regione. I risultati di queste analisi rivelano un'interfaccia FabF robusta e modulare, in grado di tollerare mutazioni di interfaccia apparentemente critiche, con la sola delezione di un'intera regione che ne compromette significativamente l'attività. Le analisi di struttura e sequenza degli ortologhi FabF provenienti da pathway FAS di tipo II correlati indicano una significativa conservazione dei residui di interfaccia KS FAS di tipo II e, nel complesso, supportano la sua delimitazione in regioni di interazione. Questi risultati rafforzano la nostra comprensione meccanicistica degli eventi di riconoscimento molecolare tra ACP ed enzimi FAS e forniscono un modello per l'ingegneria di pathway biosintetici dipendenti da ACP.

Misson, LE, Mindrebo, JT, Davis, TD, Patel, A., McCammon, JA, Noel, JP, Burkart, MD La plasticità interfacciale facilita l'elevata velocità di reazione della FAS malonil-CoA:ACP transacilasi, FabD. (2020) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. DOI: 10.1073 / pnas.2009805117

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Chekan, JR, McKinnie, SMK, Noel, JP, Moore, BS La biosintesi della neurotossina algale riutilizza la struttura della terpene ciclasi trasformandola in una β-preniltransferasi. (2020) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. DOI: 10.1073 / pnas.2001325117

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Mindrebo, JT, Patel, A., Kim, WE, Davis, TD, Chen, A., Bartholow, TG, La Clair, JJ, McCammon, JA, Noel, JP, Burkart, MD Meccanismo di controllo delle sintasi β-chetoacil-ACP in allungamento. (2020) Nature Communications. 11(1):1727. DOI: 10.1038/s41467-020-15455-x

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Lynch, JH, Qian, Y., Guo, L., Maoz, I., Huang, XQ, Garcia, AS, Louie, G., Bowman, ME, Noel, JP, Morgan, JA, Dudareva, N. Modulazione della formazione di auxina da parte del percorso biosintetico della fenilalanina citosolica. (2020) Biologia chimica della natura. DOI: 10.1038/s41589-020-0519-8

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Vickery, CR, McCulloch, IP, Sonnenschein, EC, Beld, J., Noel, JP, Burkart, MD Analisi delle sintasi modulari tramite inibizione: un approccio chimico e genetico complementare. (2020) Lettere di chimica bioorganica e farmaceutica. 30(2):126820. DOI: 10.1016/j.bmcl.2019.126820

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Burke, JR, La Clair, JJ, Philippe, RN, Pabis, A., Corbella, M., Jez, JM, Cortina, GA, Kaltenbach, M., Bowman, ME, Louie, GV, Woods, KB, Nelson, AT, Tawfik, DS, Kamerlin, SCL, Noel, JP L'attivazione del substrato bifunzionale tramite un residuo di arginina guida la catalisi nelle isomerasi calcone (2019) Catalisi ACS. 9(9):8388−8396. DOI: https://doi.org/10.1021/acscatal.9b01926

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Thomas, ST, Louie, GV, Lubin, JW, Lundblad, V., Noel, JP Specificità del substrato e ingegneria della mevalonato 5-fosfato decarbossilasi. (2019) Biologia chimica ACS. 14(8):1767-1779. DOI: 10.1021/acschembio.9b00322

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Una biforcazione della via del mevalonato (MVA) è stata recentemente scoperta nei batteri del phylum Chloroflexi. In questa via alternativa per la biosintesi dell'isopentenilpirofosfato (IPP), il penultimo passaggio è la decarbossilazione di ()-mevalonato 5-fosfato (()-MVAP) a isopentenil fosfato (IP), seguita dalla fosforilazione ATP-dipendente di IP a IPP catalizzata dall'isopentenil fosfato chinasi (IPK). In particolare, la reazione di decarbossilazione è catalizzata dalla mevalonato 5-fosfato decarbossilasi (MPD), che condivide una notevole similarità di sequenza con la mevalonato difosfato decarbossilasi (MDD) della via classica del MVA. Dimostriamo che un enzima originariamente annotato come MDD dal batterio Chloroflexi possiede la stessa efficienza catalitica per ()-MVAP e ()-mevalonato 5-difosfato (()-MVAPP). Inoltre, la base molecolare di questa doppia specificità è rivelata dalle strutture cristalline a raggi X a risoluzione quasi atomica di MPD/MDD legate a ()-MVAP o ()-MVAPP. Questi risultati, combinati con confronti di sequenza e struttura di questo enzima batterico, MDD funzionali e diversi MPD presunti, delineano i residui chiave del sito attivo che conferiscono specificità di substrato e distinguono funzionalmente le classi di enzimi MPD e MDD. Ampie analisi di sequenza hanno identificato MPD funzionali nella classe degli archei alobatteri che erano stati annotati come MDD. Infine, non sono stati identificati candidati MPD eucariotici, suggerendo l'assenza del pathway MVA alternativo (altMVA) in tutti gli eucarioti, comprese, paradossalmente, le piante, che codificano universalmente un omologo strutturale e funzionale di IPK. Inoltre, abbiamo sviluppato un ceppo ingegnerizzato vitale di come modello metabolico e una piattaforma di biologia sintetica per l'ingegneria enzimatica e la biosintesi dei terpeni in cui il pathway MVA classico è stato sostituito con il pathway altMVA.

Seto, Y., Yasui, R., Kameoka, H., Tamiru, M., Cao, M., Terauchi, R., Sakurada, A., Hirano, R., Kisugi, T., Hanada, A., Umehara, M., Seo, E., Akiyama, K., Burke, J., Takeda-Kamiya, N., Li, W., Hirano, Y., Hakoshima, T., Mashiguchi, K., Noel, JP, Kyozuka, J., Yamaguchi, S. Percezione e disattivazione dello strigolattone da parte del recettore idrolasi DWARF14. (2019) Nature Communications. 10(1):191. DOI: 10.1038/s41467-018-08124-7

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Henry, LK, Thomas, ST, Widhalm, JR, Lynch, JH, Davis, TC, Kessler, SA, Bohlmann, J., Noel, JP, Dudareva, N. Contributo dell'isopentenil fosfato al metabolismo dei terpenoidi delle piante. (2018) Piante della natura. DOI: 10.1038 / s41477-018-0220-z

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Kaltenbach, M., Burke, JR, Dindo, M., Pabis, A., Munsberg, FS, Rabin, A., Kamerlin, SCL, Noel, JP, Tawfik, DS Evoluzione della calcone isomerasi da un antenato non catalitico. (2018) Biologia chimica della natura. DOI: 10.1038/s41589-018-0042-3

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Vickery, CR, Cardenas, J., Bowman, M., Burkart, MD, Da Silva, NA, Noel, JP Un approccio accoppiato in vitro/in vivo per progettare un PKS eterologo di tipo III per migliorare la biosintesi del polichetide in Saccharomyces cerevisiae. (2018) Biotecnologia e bioingegneria. DOI: 10.1002/bit.26564

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Stewart, C., Woods, K., Macias, G., Allan, AC, Hellens, RP, Noel, JP Architetture molecolari delle polichetidi sintasi di tipo III specifiche dell'acido benzoico. (2017) Acta Crystallographica. Sezione D, Biologia strutturale. 73(Pt 12):1007-1019. DOI: 10.1107/S2059798317016618

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Kersten, RD, Lee, S., Fujita, D., Pluskal, T., Kram, S., Smith, JE, Iwai, T., Noel, JP, Fujita, M., Weng, JK Una sintasi del sesquiterpene del bourbonano delle alghe rosse definita mediante analisi XRD su spugna cristallina accoppiata a NMR su scala di microgrammi. (2017) Giornale della Società chimica americana. DOI: 10.1021/jacs.7b09452

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Wu, CC, Baiga, TJ, Downes, M., La Clair, JJ, Atkins, AR, Richard, SB, Fan, W., Stockley-Noel, TA, Bowman, ME, Noel, JP, Evans, RM Basi strutturali per la legatura specifica del recettore δ attivato dal proliferatore del perossisoma. (2017) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 114(13):E2563-E2570. DOI: 10.1073/pnas.1621513114

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Mindrebo, JT, Nartey, CM, Seto, Y., Burkart, MD, Noel, JP Svelata la diversità funzionale della superfamiglia delle alfa/beta idrolasi nel regno vegetale. (2016) Opinione attuale in biologia strutturale. 41:233-246. DOI: 10.1016/j.sbi.2016.08.005

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Levsh, O., Chiang, YC, Tung, CF, Noel, JP, Wang, Y., Weng, JK Gli stati conformazionali dinamici determinano la selettività verso il substrato nativo in un'aciltransferasi substrato-permissiva. (2016) Biochimica. 55(45):6314-6326. DOI: 10.1021/acs.biochem.6b00887

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Weng, JK, Ye, M., Li, B., Noel, JP La coevoluzione del metabolismo ormonale e delle reti di segnalazione amplia la plasticità adattiva delle piante. (2016) Cellula. 166(4):881-93. DOI: 10.1016/j.cell.2016.06.027

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Koo, HJ, Vickery, CR, Xu, Y., Louie, GV, O'Maille, PE, Bowman, M., Nartey, CM, Burkart, MD, Noel, JP Potenziale biosintetico delle sesquiterpene sintasi: profili di prodotto della premnaspirodiene sintasi del giusquiamo egiziano e mutanti correlati. (2016) Rivista di antibiotici. 69(7):524-33. DOI: 10.1038/ja.2016.68

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El Gamal, A., Agarwal, V., Diethelm, S., Rahman, I., Schorn, MA, Sneed, JM, Louie, GV, Whalen, KE, Mincer, TJ, Noel, JP, Paul, VJ, Moore, BS La biosintesi del tetrabromopirrolo, precursore dell'insediamento dei coralli nei batteri marini, avviene tramite una coppia di enzimi brominasi-tioesterasi adattata in modo unico. (2016) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 113(14):3797-802. DOI: 10.1073/pnas.1519695113

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I pirroli alogenati (alopirroli) sono gruppi chimici comuni presenti nei prodotti naturali batterici bioattivi. I gruppi alopirrolici dei composti contenenti mono- e dialogetopirroli derivano da un meccanismo conservato in cui un gruppo pirrolilico derivato dalla prolina, legato a una proteina carrier, viene prima alogenato e poi elaborato da estensioni peptidiche o polichetidiche. Questo paradigma viene interrotto durante la biosintesi batterica marina pseudoalteromonas del tetrabromopirrolo (1), che deriva dalla sostituzione del carbossilato derivato dalla prolina con un atomo di bromo. Per comprendere le basi molecolari della bromurazione decarbossilativa nella biosintesi di 1, abbiamo sequenziato due genomi di Pseudoalteromonas e identificato un locus conservato di quattro geni che codifica per gli enzimi coinvolti nella sua biosintesi completa. Attraverso la ricostituzione in vitro totale della biosintesi di 1 utilizzando enzimi purificati e l'interrogazione biochimica dei singoli passaggi biochimici, dimostriamo che tutti e quattro gli atomi di bromo in 1 sono installati dall'azione di una singola alogenasi flavina-dipendente: Bmp2. La tetrabromurazione del pirrolo induce una reazione di scarico mediata dalla tioesterasi dalla proteina carrier e attiva l'intermedio biosintetico per la decarbossilazione. Informazioni sull'attività tetrabromurante di Bmp2 sono state ottenute dalla struttura cristallina ad alta risoluzione dell'alogenasi confrontata con l'alogenasi strutturalmente omologa Mpy16 che forma solo un pirrolo dialogenato nella biosintesi del marinopirrolo. La mutagenesi guidata dalla struttura della proposta tasca di legame al substrato di Bmp2 ha portato a una riduzione del grado di alogenazione catalizzata. Il nostro studio fornisce una base biogenetica per la biosintesi di 1 e getta solide basi per indagare il potenziale biosintetico per la produzione di 1 nei (meta)genomi marini.

Vickery, CR, La Clair, JJ, Burkart, MD, Noel, JP Raccolta dei macchinari biosintetici che coltivano una varietà di prodotti naturali vegetali indispensabili. (2016) Opinione attuale in biologia chimica. 31:66-73. DOI: 10.1016/j.cbpa.2016.01.008

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Zheng, Z., Guo, Y., Novák, O., Chen, W., Ljung, K., Noel, JP, Chory, J. Il metabolismo locale dell'auxina regola l'allungamento dell'ipocotile indotto dall'ambiente. (2016) Piante della natura. 2:16025. DOI: 10.1038/nplants.2016.25

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Ma, D., Li, X., Guo, Y., Chu, J., Fang, S., Yan, C., Noel, JP, Liu, H. Il criptocromo 1 interagisce con PIF4 per regolare l'allungamento dell'ipocotile mediato dalle alte temperature in risposta alla luce blu. (2016) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 113(1):224-9. DOI: 10.1073/pnas.1511437113

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Kersten, RD, Diedrich, JK, Yates, JR, Noel, JP Modificazione post-traduzionale basata sul meccanismo e inattivazione nelle sintasi dei terpeni. (2015) Biologia chimica ACS. 10(11):2501-11. DOI: 10.1021/acschembio.5b00539

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Henry, LK, Gutensohn, M., Thomas, ST, Noel, JP, Dudareva, N. Gli ortologhi dell'isopentenil fosfato chinasi archeale regolano la produzione di terpenoidi nelle piante. (2015) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 112(32):10050-5. DOI: 10.1073/pnas.1504798112

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Rising, KA, Crenshaw, CM, Koo, HJ, Subramanian, T., Chehade, KA, Starks, C., Allen, KD, Andres, DA, Spielmann, HP, Noel, JP, Chappell, J. Formazione di un nuovo alcaloide macrociclico dall'analogo innaturale del farnesil difosfato anilinogeranil difosfato mediante 5-epi-aristolochene sintasi. (2015) Biologia chimica ACS. 10(7):1729-36. DOI: 10.1021/acschembio.5b00145

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Pan, H., Zhou, R., Louie, GV, Mühlemann, JK, Bomati, EK, Bowman, ME, Dudareva, N., Dixon, RA, Noel, JP, Wang, X. Studi strutturali della cinnamil-CoA reduttasi e della cinnamil-alcol deidrogenasi, enzimi chiave della biosintesi del monolignol. (2014) Cellula vegetale. 26(9):3709-27. DOI: 10.1105/tpc.114.127399

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Vickery, CR, Kosa, NM, Casavant, EP, Duan, S., Noel, JP, Burkart, MD Struttura, biochimica e inibizione delle 4'-fosfopanteteinil transferasi essenziali di due specie di micobatteri. (2014) Biologia chimica ACS. 9(9):1939-44. DOI: 10.1021/cb500263p

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Procko C., Crenshaw CM, Ljung K., Noel, JP, Chory, J. L'auxina generata dai cotiledoni è necessaria per la crescita dell'ipocotile indotta dall'ombra nella Brassica rapa. (2014) Fisiologia vegetale. 165(3):1285-1301. DOI: 10.1104/pp.114.241844

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L'architettura della pianta è ottimizzata per l'ambiente luminoso locale. In risposta all'ombra fogliare o alla vicinanza di vicini (luce da bassa a rossa lontana), alcune specie vegetali mostrano fenotipi che evitano l'ombra, tra cui una maggiore crescita di fusto e ipocotile, che aumenta la probabilità di superare le piante concorrenti. Se l'ombra persiste, la fioritura precoce e la riallocazione delle risorse di crescita all'allungamento del fusto influiscono in ultima analisi sulla resa dei tessuti raccoglibili nelle specie coltivate. Studi precedenti hanno dimostrato che la crescita dell'ipocotile in condizioni di ombra da bassa a rossa lontana dipende in larga misura dal fotorecettore fitocromo B e dal fitormone auxina. Tuttavia, la posizione in cui viene percepita l'ombra nella pianta e il modo in cui l'auxina regola la crescita spazialmente sono meno noti. Utilizzando la specie di coltura oleaginosa e orticola Brassica rapa, dimostriamo che la percezione dell'ombra da bassa a rossa lontana da parte dei cotiledoni innesca l'allungamento delle cellule ipocotiliche e l'espressione del gene bersaglio dell'auxina. Inoltre, abbiamo scoperto che, in seguito alla percezione dell'ombra, si verificano livelli elevati di auxina secondo un gradiente basipeto lontano dai cotiledoni, coincidente con un gradiente di induzione del gene bersaglio dell'auxina. Questi risultati mostrano che l'auxina generata dai cotiledoni regola l'allungamento dell'ipocotile. Inoltre, abbiamo riscontrato in piante mature di B. rapa che l'ombra simulata non influisce sulla composizione dell'olio dei semi, ma può influire sulla resa dei semi. Ciò suggerisce che, in contesti di campo in cui può verificarsi un ombreggiamento reciproco tra le piante, è necessario raggiungere un equilibrio tra densità delle piante e resa dei semi per pianta per ottenere la massima resa in olio, mentre la composizione dell'olio potrebbe rimanere costante.

Bomati, EK, Haley, JE, Noel, JP, Deheyn, DD Confronto spettrale e strutturale tra proteine fluorescenti verdi brillanti e deboli in Amphioxus. (2014) Relazioni scientifiche. 4:5469. DOI: 10.1038/srep05469

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Hoppmann, C., Lacey, VK, Louie, GV, Wei, J., Noel, JP, Wang, L. Codifica genetica di amminoacidi click fotoswitchabili in Escherichia coli e cellule di mammifero. (2014) Angewandte Chemie. 53(15):3932-6. DOI: 10.1002/anie.201400001

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Beld, J., Sonnenschein, EC, Vickery, CR, Noel, JP, Burkart, MD Le fosfopanteteinil transferasi: catalisi di una modifica post-traduzionale cruciale per la vita. (2014) Rapporti sui prodotti naturali. 31(1):61-108. DOI: 10.1039/c3np70054b

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Schorn, M., Zettler, J., Noel, JP, Dorrestein, PC, Moore, BS, Kaysser, L. Basi genetiche per la biosintesi della classe farmaceuticamente importante degli inibitori del proteasoma epossichetonici. (2014) Biologia chimica ACS. 9(1):301-9. DOI: 10.1021/cb400699p

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Dellas, N., Thomas, ST, Manning, G., Noel, JP Scoperta di un'alternativa metabolica al percorso classico del mevalonato. (2013) Evita. 2:e00672. DOI: 10.7554/eLife.00672

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Teufel, R., Miyanaga, A., Michaudel, Q., Stull, F., Louie, G., Noel, JP, Baran, PS, Palfey, B., Moore, BS La doppia ossidazione mediata dalla flavina controlla un riarrangiamento enzimatico di tipo Favorskii. (2013) Natura. 503(7477):552-556. DOI: 10.1038/natura12643

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Lacey, VK, Louie, GV, Noel, JP, Wang, L. Ampliamento della libreria e della diversità dei substrati della pirrolisil-tRNA sintetasi per incorporare amminoacidi non naturali contenenti anelli coniugati. (2013) Chembiochimica. 14(16):2100-5. DOI: 10.1002/cbic.201300400

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Stewart, C., Vickery, CR, Burkart, MD, Noel, JP Confluenza tra biologia strutturale e chimica: sintasi dei polichetidi vegetali come biocatalizzatori per un futuro basato sulla biologia. (2013) Opinione attuale in biologia vegetale. 16(3):365-72. DOI: 10.1016/j.pbi.2013.02.004

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Weng, JK, Noel, JP Chemodiversità in Selaginella: un sistema di riferimento per l'evoluzione metabolica parallela e convergente nelle piante terrestri. (2013) Frontiere nella scienza delle piante. 4:119. DOI: 10.3389/fpls.2013.00119

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Le piante primitive iniziarono a colonizzare la Terra circa 450 milioni di anni fa. Il loro successo sulla terraferma è stato in parte attribuito all'evoluzione di sistemi metabolici specializzati a partire da vie metaboliche centrali, le prime delle quali producevano sostanze chimiche strutturalmente e funzionalmente diverse per far fronte a una miriade di pressioni ecologiche biotiche e abiotiche. Negli ultimi due decenni, la genomica funzionale, concentrata principalmente sulle piante da fiore, ha iniziato a catalogare gli attori biosintetici alla base di varie classi di metaboliti specializzati delle piante. Tuttavia, i meccanismi molecolari che arricchiscono le vie metaboliche specializzate durante l'evoluzione delle piante terrestri rimangono in gran parte inesplorati. Selaginella è un genere di licopodiofita esistente, rappresentativo di un'antica linea di tracheofite. In particolare, le licopodiofite si sono differenziate dalle eufillofite oltre 400 milioni di anni fa. Il recente completamento della sequenza dell'intero genoma di una licopodiofita esistente, S. moellendorffii, fornisce nuove risorse genomiche e biochimiche per lo studio dell'evoluzione metabolica nelle piante vascolari. 400 milioni di anni di evoluzione indipendente di licopodiofite ed eufillofite hanno portato a numerosi tratti metabolici confinati a ciascun lignaggio. Sorprendentemente, in Selaginella è stata identificata una serie di metaboliti specializzati, generalmente considerati limitati alle piante con semi. I lavori iniziali suggerivano che Selaginella fosse priva di evidenti omologhi catalitici noti per essere coinvolti nella biosintesi di metaboliti specializzati ben studiati nelle piante con semi. Pertanto, queste analisi funzionali iniziali suggeriscono che gli stessi fenotipi chimici siano emersi in modo indipendente, più comunemente di quanto previsto dalla nostra comprensione convenzionale dell'evoluzione del metabolismo. In particolare, l'emergere di meccanismi catalitici analoghi e omologhi attraverso l'evoluzione convergente e parallela, rispettivamente, sembra essersi verificato ripetutamente in diversi lignaggi vegetali.

Guo Y., Zheng Z., La Clair, JJ, Chory, J., Noel, JP Percezione della karrikin derivata dal fumo da parte dell'α/β-idrolasi KAI2 di Arabidopsis. (2013) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 110(20):8284-9. DOI: 10.1073/pnas.1306265110

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Zheng, Z., Guo, Y., Novák, O., Dai, X., Zhao, Y., Ljung, K., Noel, JP, Chory, J. Coordinamento della biosintesi dell'auxina e dell'etilene da parte dell'aminotransferasi VAS1. (2013) Biologia chimica della natura. 9(4):244-6. DOI: 10.1038/nchembio.1178

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Weng, JK, Noel, JP La straordinaria flessibilità e promiscuità del metabolismo specializzato. (2012) Simposi di biologia quantitativa a Cold Spring Harbor. 77:309-20. DOI: 10.1101/sqb.2012.77.014787

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I percorsi metabolici sono spesso considerati "perfezionati" o almeno prevedibili, poiché i substrati si riorganizzano in modo efficiente nei prodotti grazie all'intervento di un enzima ottimizzato. Inoltre, i singoli passaggi catalitici si collegano, formando una miriade di circuiti metabolici che sono spesso modellati con un elevato grado di certezza. Tuttavia, a un esame più attento, la maggior parte degli enzimi non è precisa rispetto alla propria attività, utilizzando non un solo substrato, ma spesso una varietà, e producendo non un solo prodotto, ma una diversità. Pertanto, i sistemi metabolici assemblati da enzimi che possiedono vari gradi di quella che può essere definita promiscuità catalitica non sono chiari e restrittivi; piuttosto, a volte possono operare in modo stocastico nell'ambiente intracellulare. Questa "disordine" complica la nostra comprensione del comportamento cellulare normale e aberrante, mentre paradossalmente getta le basi per futuri adattamenti metabolici vantaggiosi per gli organismi ospiti. La promiscuità catalitica è intrinsecamente associata alla natura dinamica delle strutture enzimatiche e ai loro meccanismi chimici, entrambi fondamentali per l'evolutività enzimatica e metabolica. Oltre al metabolismo primario (centrale), essenziale per la sopravvivenza, gli organismi possiedono anche sistemi metabolici secondari (specializzati) altamente elaborati. Questi enzimi e percorsi metabolici specializzati spesso forniscono strategie adattative uniche per una miriade di organismi e le loro popolazioni in ecosistemi difficili e mutevoli. In generale, gli enzimi del metabolismo specializzato mostrano attività cinetiche attenuate e una maggiore promiscuità catalitica rispetto ai loro parenti filogenetici radicati nel metabolismo primario. Proponiamo che l'evolutività possa essere un tratto selezionato in molti sistemi metabolici specializzati distribuiti in popolazioni di organismi esposti a pressioni ambientali biotiche e abiotiche in continua fluttuazione. Poiché i metaboliti minori derivanti dalla disorganizzazione catalitica hanno fornito una maggiore fitness della popolazione, la specificità si è attenuata e l'efficienza catalitica è stata attenuata. Questa visione aggiornata fornisce una base meccanicistica per raggiungere una comprensione più profonda delle basi evolutive dell'esplosione della chemiodiversità in natura.

Elleder, D., Baiga, TJ, Russell, RL, Naughton, JA, Hughes, SH, Noel, JP, Young, JA Identificazione di un inibitore 3-amminoimidazo[1,2-a]piridina della trascrittasi inversa dell'HIV-1. (2012) Rivista di virologia. 9:305. DOI: 10.1186/1743-422X-9-305

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Liscombe, DK, Louie, GV, Noel, JP Architetture, meccanismi ed evoluzione molecolare delle metiltransferasi naturali. (2012) Rapporti sui prodotti naturali. 29(10):1238-50. DOI: 10.1039/c2np20029e

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Zhang, M., Wang, XJ, Chen, X., Bowman, ME, Luo, Y., Noel, JP, Ellington, AD, Etzkorn, FA, Zhang, Y. Analisi strutturale e cinetica del cross-talk tra prolil-isomerizzazione/fosforilazione nel codice CTD. (2012) Biologia chimica ACS. 7(8):1462-70. DOI: 10.1021/cb3000887

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Il dominio C-terminale (CTD) dell'RNA polimerasi II eucariotica è un regolatore essenziale della trascrizione mediata dall'RNA polimerasi II. È composto da molteplici ripetizioni di una sequenza consenso Tyr(1)Ser(2)Pro(3)Thr(4)Ser(5)Pro(6)Ser(7). La regolazione della trascrizione da parte del CTD è mediata sia dalla fosforilazione delle serine che dalla prolil isomerizzazione delle due proline. È interessante notare che i siti di fosforilazione sono tipicamente vicini alle proline, e quindi la conformazione della prolina adiacente potrebbe influenzare la specificità delle chinasi e delle fosfatasi corrispondenti. L'evidenza sperimentale di un'interazione tra questi due meccanismi regolatori è stata finora elusiva. Pin1 è una peptidil-prolil isomerasi (PPIasi) altamente conservata, specifica per la fosforilazione, che riconosce il motivo fosfo-Ser/Thr (pSer/Thr)-Pro con CTD come uno dei suoi substrati primari in vivo. Nel presente studio, forniamo istantanee strutturali e prove cinetiche che supportano il concetto di cross-talk tra isomerizzazione e fosforilazione del prolil. Abbiamo determinato le strutture di Pin1 legate a due isosteri di substrato che imitano i peptidi contenenti motivi pSer/Thr-Pro in conformazioni cis o trans. I risultati dimostrano inequivocabilmente l'utilità degli isosteri alchenici bloccati in cis e trans come imitatori geometrici precisi dei peptidi legati a un bersaglio proteico. Sulla base di questo risultato, abbiamo identificato un caso specifico in cui Pin1 influenza in modo diverso la velocità di defosforilazione catalizzata da due fosfatasi (Scp1 e Ssu72) che hanno come bersaglio lo stesso residuo di serina nella ripetizione dell'eptade CTD, ma hanno preferenze diverse per lo stato di isomerizzazione del residuo di prolina adiacente. Questi dati esemplificano per la prima volta come la modulazione dell'isomerizzazione della prolina possa avere un impatto cinetico sulla trasduzione del segnale nella regolazione della trascrizione.

Weng, JK, Philippe, RN, Noel, JP L'aumento della chemiodiversità nelle piante. (2012) Scienza. 336(6089):1667-70. DOI: 10.1126/science.1217411

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Ngaki, MN, Louie, GV, Philippe, RN, Manning, G., Pojer, F., Bowman, ME, Li, L., Larsen, E., Wurtele, ES, Noel, JP Evoluzione della curva della calcone-isomerasi dal legame con gli acidi grassi alla catalisi stereospecifica. (2012) Natura. 485(7399):530-3. DOI: 10.1038/natura11009

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Gli enzimi metabolici specializzati biosintetizzano sostanze chimiche di importanza ecologica, spesso condividendo un pedigree con gli enzimi metabolici primari. Tuttavia, la discendenza dell'enzima calcone isomerasi (CHI) è rimasta sconosciuta. Nelle piante vascolari, la conversione dei calconi in (S)-flavanoni chirali, catalizzata da CHI, è un passaggio fondamentale nella produzione di flavonoidi vegetali, composti che contribuiscono all'attrazione, alla difesa e allo sviluppo. CHI opera vicino al limite di diffusione con controllo stereospecifico. Sebbene associata principalmente alle piante, la piega CHI si verifica in diverse altre linee eucariotiche e in alcuni batteri. In questo articolo riportiamo le strutture cristalline, le proprietà di legame dei ligandi e la caratterizzazione funzionale in vivo di una famiglia di pieghe CHI non catalitiche provenienti dalle piante. Arabidopsis thaliana contiene cinque geni attivamente trascritti che codificano per proteine CHI-fold, tre dei quali codificano anche sequenze ammino-terminali di transito dei cloroplasti. Queste tre proteine CHI-fold si localizzano nei plastidi, il sito della biosintesi de novo degli acidi grassi nelle cellule vegetali. Inoltre, i loro profili di espressione sono correlati a quelli degli enzimi biosintetici principali degli acidi grassi, con un'espressione massima nei semi e coincidente con un aumento dell'accumulo di acidi grassi nell'embrione in via di sviluppo. In vitro, queste proteine sono proteine leganti gli acidi grassi (FAP). Le piante di A. thaliana knockout per le FAP mostrano livelli elevati di acido α-linolenico e marcati difetti riproduttivi, tra cui una formazione aberrante dei semi. In particolare, la scoperta delle FAP definisce l'evoluzione adattativa di un enzima stereospecifico e "perfezionato" cataliticamente da un antenato non enzimatico in un periodo definito dell'evoluzione vegetale.

Auldridge, ME, Guo, Y., Austin, MB, Ramsey, J., Fridman, E., Pichersky, E., Noel, JP Attività decarbossilasi emergente e attenuazione dell'attività α/β-idrolasi durante l'evoluzione della biosintesi del metilchetone nel pomodoro. (2012) Cellula vegetale. 24(4):1596-607. DOI: 10.1105/tpc.111.093997

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Weng, JK, Noel, JP Analisi struttura-funzione delle polichetidi sintasi di tipo III delle piante. (2012) Metanfetamina Enzimol. 515:317-35. DOI: 10.1016/B978-0-12-394290-6.00014-8

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Shen, B., Xiang, Z., Miller, B., Louie, G., Wang, W., Noel, JP, Gage, FH, Wang, L. Codifica genetica di amminoacidi non naturali nelle cellule staminali neurali e segnalazione ottica di cambiamenti di dominio sensibili al voltaggio nei neuroni differenziati. (2011) Cellule staminali. 29(8):1231-40. DOI: 10.1002/stem.679

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Hess, BA, Smentek, L., Noel, JP, O'Maille, PE Vincoli fisici sulla diversità dei sesquiterpeni derivanti dalla ciclizzazione del carbocatione eudesm-5-ile. (2011) Giornale della Società chimica americana. 133(32):12632-41. DOI: 10.1021/ja203342p

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Le origini biogene dei terpeni ciclici complessi derivano dall'interazione di enzimi e dalla reattività intrinseca delle specie carbocationiche nei principali punti di ramificazione lungo i percorsi di ciclizzazione intramolecolare, determinando in ultima analisi la distribuzione dei tipi di scheletro terpenico in natura. Le piante solanacee biosintetizzano composti di difesa chimica, derivati in gran parte dai sesquiterpeni di tipo eremofilano e spirovetivano. Questi scheletri idrocarburici condividono un'origine biogena comune, derivante da riarrangiamenti alternativi di Wagner-Meerwein del carbocatione eudesm-5-ile durante la ciclizzazione del farnesil pirofosfato (FPP) catalizzata dalle sesquiterpene sintasi. Mentre lo scheletro spirojatamane condivide lo stesso intermedio carbocationico, questa classe di sesquiterpeni non è stata segnalata nelle Solanaceae ed è estremamente rara in natura. Per indagare le basi fisiche dei riarrangiamenti alternativi del carbocatione eudesm-5-ile, abbiamo condotto analisi di meccanica quantistica (QM) per calcolare le conformazioni, le energie e gli stati di transizione ammissibili che collegano i conformeri del carbocatione eudesm-5-ile agli scheletri di eremofilene, spirovetivano e spirojatamane. Inoltre, abbiamo condotto indagini parallele su sistemi semplificati di carbocationi decalini per esaminare il contributo dei sostituenti dell'anello alle conformazioni ammissibili e ai percorsi di riarrangiamento. Il nostro studio rivela che i sostituenti dell'anello espandono lo spazio conformazionale accessibile al carbocatione eudesm-5-ile, bloccando stericamente i riarrangiamenti in determinati contesti. Dalla nostra analisi, definiamo una soglia conformazionale per ogni possibile riarrangiamento basata sugli angoli diedri che descrivono la geometria dello stato di transizione. Inoltre, i nostri calcoli indicano che i riarrangiamenti di migrazione del metilene che portano a composti spiro sono termodinamicamente dominanti nei sistemi di carbocationi eudesm-5-ilici e decalina più semplici. È interessante notare che l'abbondanza teorica dei tipi scheletrici di sesquiterpeni derivanti dalla reattività intrinseca del carbocatione eudesm-5-ilico è in netto contrasto con la loro abbondanza naturale attualmente nota. Vengono discusse le implicazioni di questi risultati per le traiettorie catalitiche catalizzate dalle sesquiterpeni sintasi.

Takimoto, JK, Dellas, N., Noel, JP, Wang, L. Basi stereochimiche per la pirrolisil-tRNA sintetasi ingegnerizzata e l'incorporazione efficiente in vivo di amminoacidi non nativi strutturalmente divergenti. (2011) Biologia chimica ACS. 6(7):733-43. DOI: 10.1021/cb200057a

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Hothorn, M., Belkhadir, Y., Dreux, M., Dabi, T., Noel, JP, Wilson, IA, Chory, J. Basi strutturali della percezione dell'ormone steroideo da parte del recettore chinasi BRI1. (2011) Natura. 474(7352):467-71. DOI: 10.1038/natura10153

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Louie, GV, Bowman, ME, Tu, Y., Mouradov, A., Spangenberg, G., Noel, JP Le analisi struttura-funzione di una O-metiltransferasi dell'acido caffeico del loietto perenne rivelano la base molecolare della preferenza del substrato. (2010) Cellula vegetale. 22(12):4114-27. DOI: 10.1105/tpc.110.077578

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Noel, JP Biologia chimica: il metabolismo sintetico diventa ecologico. (2010) Natura. 468(7322):380-1. DOI: 10.1038/468380a

Tu, Y., Rochfort, S., Liu, Z., Ran, Y., Griffith, M., Badenhorst, P., Louie, GV, Bowman, ME, Smith, KF, Noel, JP, Mouradov, A., Spangenberg, G. Analisi funzionali dei geni dell'acido caffeico O-metiltransferasi e della cinnamoil-CoA-reduttasi del loietto perenne (Lolium perenne). (2010) Cellula vegetale. 22(10):3357-73. DOI: 10.1105/tpc.109.072827

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Yu, G., Nguyen, TT, Guo, Y., Schauvinhold, I., Auldridge, ME, Bhuiyan, N., Ben-Israel, I., Iijima, Y., Fridman, E., Noel, JP, Pichersky, E. Funzioni enzimatiche delle metilchetone sintasi 1 e 2 del pomodoro selvatico. (2010) Fisiologia vegetale. 154(1):67-77. DOI: 10.1104/pp.110.157073

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Dellas, N., Noel, JP La mutazione dell'isopentenil fosfato chinasi archeale evidenzia il meccanismo e guida la fosforilazione di ulteriori monofosfati isoprenoidi. (2010) Biologia chimica ACS. 5(6):589-601. DOI: 10.1021/cb1000313

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La biosintesi dell'isopentenil difosfato (IPP) a partire dal mevalonato (MVA) o dalla via dell'1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato (DXP) fornisce il metabolita chiave per la biosintesi primaria e secondaria degli isoprenoidi. Il metabolismo degli isoprenoidi svolge un ruolo cruciale nella stabilità della membrana, nella biosintesi degli steroidi, nella produzione di vitamine, nella localizzazione proteica, nella difesa e nella comunicazione, nella fotoprotezione, nel trasporto degli zuccheri e nella biosintesi delle glicoproteine. Recentemente, è stato scoperto un ramo alternativo della via dell'MVA nell'archeobatterio Methanocaldococcus jannaschii che coinvolge una chinasi a piccole molecole, l'isopentenil fosfato chinasi (IPK). L'IPK appartiene alla superfamiglia delle chinasi degli amminoacidi (AAK). In vitro, l'IPK fosforila l'isopentenil monofosfato (IPP) in una reazione dipendente da ATP e Mg(2+) che produce IPP. In questo articolo, descriviamo le strutture cristalline dell'IPK di M. jannaschii, raffinate a risoluzioni nominali di 2.0-2.8 A. In particolare, un residuo di istidina del sito attivo (His60) forma un legame idrogeno con il fosfato terminale sia del substrato che del prodotto. Questo residuo di His funge da marcatore per un sottoinsieme della famiglia AAK che catalizza la fosforilazione dei gruppi funzionali fosfato o fosfonato; la famiglia più ampia include chinasi carbossi-dirette, prive di questo residuo del sito attivo. Utilizzando l'analisi cinetica allo stato stazionario dei mutanti H60A, H60N e H60Q, è stato dimostrato che la forma protonata dell'azoto Nepsilon(2) di His60 è essenziale per la catalisi, molto probabilmente attraverso la stabilizzazione del legame idrogeno dello stato di transizione che accompagna la transfosforilazione. Inoltre, le strutture sono servite come punto di partenza per l'ingegnerizzazione di mutanti IPK capaci di sintetizzare chemoenzimaticamente difosfati isoprenoidi a catena più lunga a partire da precursori monofosfati.

Zhang, M., Liu, J., Kim, Y., Dixon, JE, Pfaff, SL, Gill, GN, Noel, JP, Zhang, Y. Analisi strutturale e funzionale della reazione di trasferimento del fosforile mediata dalla fosfatasi del piccolo dominio C-terminale umano, Scp1. (2010) Scienza delle proteine. 19(5):974-86. DOI: 10.1002/pro.375

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Noel, JP, Dellas, N., Faraldos, JA, Zhao, M., Hess, BA, Smentek, L., Coates, RM, O'Maille, PE Chiarimento strutturale dei percorsi di ciclizzazione cisoide e transoide di una sesquiterpene sintasi utilizzando 2-fluorofarnesil difosfati. (2010) Biologia chimica ACS. 5(4):377-92. DOI: 10.1021/cb900295g

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Faraldos, JA, O'Maille, PE, Dellas, N., Noel, JP, Coates, RM Sesquiterpeni derivati dal bisabolile dalla ciclizzazione catalizzata dalla 5-epi-aristolochene sintasi del tabacco del (2Z,6E)-farnesil difosfato. (2010) Giornale della Società chimica americana. 132(12):4281-9. DOI: 10.1021/ja909886q

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Ben-Israel, I., Yu, G., Austin, MB, Bhuiyan, N., Auldridge, M., Nguyen, T., Schauvinhold, I., Noel, JP, Pichersky, E., Fridman, E. Molteplici fattori biochimici e morfologici sono alla base della produzione di metilchetoni nei tricomi del pomodoro. (2009) Fisiologia vegetale. 151(4):1952-64. DOI: 10.1104/pp.109.146415

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Lear, MJ, Simon, O., Foley, TL, Burkart, MD, Baiga, TJ, Noel, JP, DiPasquale, AG, Rheingold, AL, La Clair, JJ Laetirobina derivante dalla crescita parassitaria di Laetiporus sulphureus su Robinia pseudoacacia. (2009) J.Nat. prod. 72(11):1980-7. DOI: 10.1021/np9002838

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Koeduka, T., Orlova, I., Baiga, TJ, Noel, JP, Dudareva, N., Pichersky, E. La mancanza di sintesi floreale e di emissione di isoeugenolo nella Petunia axillaris subsp. parodii è dovuta a una mutazione nel gene dell'isoeugenolo sintasi. (2009) Rivista di piante. 58(6):961-9. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2009.03834.x

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Koeduka, T., Baiga, TJ, Noel, JP, Pichersky, E. Biosintesi del t-anetolo nell'anice: caratterizzazione della t-anolo/isoeugenolo sintasi e di una O-metiltransferasi specifica per una catena laterale propenilica C7-C8. (2009) Fisiologia vegetale. 149(1):384-94. DOI: 10.1104/pp.108.128066

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Il fenilpropene t-anetolo conferisce il caratteristico aroma dolce ai semi e alle foglie di anice (Pimpinella anisum, famiglia delle Apiaceae). In questo articolo riportiamo che le parti aeree della pianta di anice accumulano t-anetolo man mano che la pianta matura, con i livelli più elevati di t-anetolo riscontrati nei frutti. Sebbene la pianta di anice sia ricoperta di tricomi, il t-anetolo si accumula all'interno delle foglie e non nei tricomi o nello strato cellulare epidermico. Abbiamo ottenuto il cDNA di anice che codifica per la t-anolo/isoeugenolo sintasi 1 (AIS1), un enzima NADPH-dipendente in grado di biosintetizzare t-anolo e isoeugenolo (quest'ultimo non presente nell'anice) rispettivamente dall'acetato di cumarile e dall'acetato di coniferile. Inoltre, abbiamo ottenuto un cDNA che codifica per la S-[metil-14C]adenosil-l-metionina:t-anolo/isoeugenolo O-metiltransferasi 1 (AIMT1), un enzima in grado di convertire il t-anolo o l'isoeugenolo rispettivamente in t-anetolo o metilisoeugenolo, tramite metilazione del gruppo para-OH. I geni che codificano per AIS1 e AIMT1 sono stati espressi in tutta la pianta e i loro livelli di trascrizione erano più elevati nei frutti in via di sviluppo. La proteina AIS1 è identica al 59% all'isoeugenolo sintasi 1 della petunia (Petunia hybrida) e mostra valori di Km apparenti di 145 microm per l'acetato di cumarile e 230 microm per l'acetato di coniferile. AIMT1 preferisce l'isoeugenolo al t-anolo di un fattore 2, con valori di Km di 19.3 microm per l'isoeugenolo e 54.5 microm per la S-[metil-14C]adenosil-l-metionina. La sequenza proteica di AIMT1 è identica per circa il 40% a quella delle fenilpropene O-metiltransferasi di basilico (Ocimum basilicum) e Clarkia breweri, ma a differenza di questi enzimi, che non mostrano una grande discriminazione tra substrati con catene laterali propeniliche isomeriche, AIMT1 mostra una preferenza 10 volte maggiore per il t-anolo rispetto al chavicol e per l'isoeugenolo rispetto all'eugenolo.

O'Maille, PE, Malone, A., Dellas, N., Andes Hess, B., Smentek, L., Sheehan, I., Greenhagen, BT, Chappell, J., Manning, G., Noel, JP Esplorazione quantitativa del panorama catalitico che separa le sintasi sesquiterpeniche vegetali divergenti. (2008) Biologia chimica della natura. 4(10):617-23. DOI: 10.1038/nchembio.113

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Savaldi-Goldstein, S., Baiga, TJ, Pojer, F., Dabi, T., Butterfield, C., Parry, G., Santner, A., Dharmasiri, N., Tao, Y., Estelle, M., Noel, JP, Chory, J. Nuovi analoghi dell'auxina con effetti stimolanti la crescita nelle piante intatte rivelano una strategia chimica per migliorare la somministrazione degli ormoni. (2008) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 105(39):15190-5. DOI: 10.1073/pnas.0806324105

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La crescita delle piante dipende dall'integrazione di stimoli ambientali e vie di segnalazione dei fitormoni. Durante l'emergenza delle piantine, l'allungamento del fusto embrionale (ipocotile) funge da indicatore delle risposte dipendenti dalla luce e dagli ormoni. Abbiamo analizzato 10,000 sostanze chimiche fornite esogenamente alle piantine coltivate in luce e identificato 100 composti che promuovono l'allungamento dell'ipocotile. In particolare, un sottoinsieme di queste sostanze chimiche condivide caratteristiche strutturali con le auxine sintetiche, l'acido 2,4-diclorofenossiacetico (2,4-D) e l'acido 1-naftalenacetico (1-NAA); tuttavia, le auxine tradizionali (ad esempio, acido indolo-3-acetico [IAA], 2,4-D, 1-NAA) non hanno alcun effetto sull'allungamento dell'ipocotile. Dimostriamo che i nuovi composti agiscono come "proauxine", simili ai profarmaci. I nostri dati suggeriscono che questi composti diffondono efficacemente negli ipocotili, dove subiscono una scissione a velocità variabile, rilasciando auxine funzionali. Per studiare questo principio, abbiamo applicato una strategia di mascheramento e progettato un pro-2,4-D. A differenza del solo 2,4-D, questo pro-2,4-D ha migliorato l'allungamento dell'ipocotile. Abbiamo ulteriormente dimostrato l'utilità delle proauxine caratterizzando le risposte auxiniche in ipocotili foto-coltivati di diversi mutanti del recettore dell'auxina. Questi nuovi composti forniscono quindi un accesso sperimentale a un tessuto precedentemente inaccessibile all'applicazione esogena delle auxine. I nostri studi esemplificano il potere combinato della genetica chimica e delle analisi biochimiche per scoprire e perfezionare analoghi dei proormoni con attività selettiva in specifici tessuti vegetali. Oltre all'utilità di questi composti per affrontare questioni relative alle interazioni tra auxina e segnale luminoso, si può immaginare di utilizzare questi semplici principi per studiare altre risposte di ormoni vegetali e piccole molecole in modi controllati temporalmente e spazialmente.

Eustáquio, AS, Härle, J., Noel, JP, Moore, BS S-adenosil-L-metionina idrolasi (formatrice di adenosina), una proteina batterica e archea conservata correlata alle alogenasi dipendenti da SAM. (2008) Chembiochimica. 9(14):2215-9. DOI: 10.1002/cbic.200800341

Kumano, T., Richard, SB, Noel, JP, Nishiyama, M., Kuzuyama, T. Sintesi chemoenzimatiche di piccole molecole aromatiche prenilate utilizzando preniltransferasi di Streptomyces con specificità di substrato rilassate. (2008) Chimica bioorganica e medicinale. 16(17):8117-26. DOI: 10.1016/j.bmc.2008.07.052

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Baiga, TJ, Guo, H., Xing, Y., O'Doherty, GA, Dillin, A., Austin, MB, Noel, JP, La Clair, JJ L'induzione dei metaboliti delle larve di Caenorhabditis elegans dauer avviene tramite il trasporto nella faringe. (2008) Biologia chimica ACS. 3(5):294-304. DOI: 10.1021/cb700269e

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Tello, M., Kuzuyama, T., Heide, L., Noel, JP, Richard, SB La famiglia ABBA delle preniltransferasi aromatiche: ampliamento della diversità dei prodotti naturali. (2008) Scienze della vita cellulare e molecolare. 65(10):1459-63. DOI: 10.1007/s00018-008-7579-3

Koeduka, T., Louie, GV, Orlova, I., Kish, CM, Ibdah, M., Wilkerson, CG, Bowman, ME, Baiga, TJ, Noel, JP, Dudareva, N., Pichersky, E. Le molteplici fenilpropene sintasi presenti sia in Clarkia breweri che in Petunia hybrida rappresentano due linee proteiche distinte. (2008) Rivista di piante. 54(3):362-74. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2008.03412.x

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Tao, Y., Ferrer, JL, Ljung, K., Pojer, F., Hong, F., Long, JA, Li, L., Moreno, JE, Bowman, ME, Ivans, LJ, Cheng, Y., Lim, J., Zhao, Y., Ballaré, CL, Sandberg, G., Noel, JP, Chory, J. Per evitare l'ombra nelle piante è necessaria una rapida sintesi dell'auxina tramite un nuovo percorso dipendente dal triptofano. (2008) Cellula. 133(1):164-76. DOI: 10.1016/j.cell.2008.01.049

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Austin, MB, O'Maille, PE, Noel, JP I tanghi biosintetici in evoluzione si muovono in paesaggi meccanicistici. (2008) Biologia chimica della natura. 4(4):217-22. DOI: 10.1038/nchembio0408-217

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Ferrer, JL, Austin, MB, Stewart, C., Noel, JP Struttura e funzione degli enzimi coinvolti nella biosintesi dei fenilpropanoidi. (2008) Fisiologia vegetale e biochimica. 46(3):356-70. DOI: 10.1016/j.plaphy.2007.12.009

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In quanto componente principale del metabolismo specializzato delle piante, i percorsi biosintetici dei fenilpropanoidi forniscono antocianine per la pigmentazione, flavonoidi come i flavoni per la protezione dai danni da luce UV, vari induttori flavonoidi e isoflavonoidi dei geni di nodulazione di Rhizobium, lignina polimerica per il supporto strutturale e diverse fitoalessine antimicrobiche. Come costituenti di diete ricche di vegetali e di una varietà di agenti medicinali a base di erbe, i fenilpropanoidi mostrano attività chemiopreventiva del cancro, antimitotica, estrogenica, antimalarica, antiossidante e antiasmatica misurabili. I benefici per la salute derivanti dal consumo di vino rosso, che contiene quantità significative di 3,4',5-triidrossistilbene (resveratrolo) e altri fenilpropanoidi, evidenziano la crescente consapevolezza nella comunità medica e nel pubblico in generale circa la potenziale importanza dietetica di questi composti di origine vegetale. Fino a un decennio fa, si sapeva poco sulla struttura tridimensionale degli enzimi coinvolti in queste vie biosintetiche altamente ramificate. Dieci anni fa, abbiamo avviato analisi cristallografiche a raggi X di enzimi chiave di questa via, integrate da studi biochimici e di ingegneria enzimatica. Abbiamo inizialmente studiato la calcone sintasi (CHS), il punto di ingresso della via dei flavonoidi, e la sua stretta parente, la stilbene sintasi (STS). Sono seguiti lavori sulle O-metil transferasi (OMT) coinvolte nelle modificazioni di calcone, isoflavonoidi e precursori metabolici della lignina. Più recentemente, i nostri gruppi e altri hanno esteso la gamma di indagini strutturali sulla via dei fenilpropanoidi per includere gli enzimi a monte responsabili del reclutamento iniziale di fenilalanina e tirosina, nonché una serie di reduttasi, aciltransferasi ed enzimi ausiliari di adattamento dei metaboliti derivati dai fenilpropanoidi. Questi studi struttura-funzione forniscono collettivamente una visione completa di un aspetto importante del metabolismo dei fenilpropanoidi. Più specificamente, queste intuizioni a risoluzione atomica sull'architettura e sui meccanismi alla base degli enzimi che metabolizzano i fenilpropanoidi contribuiscono alla nostra comprensione dell'emergere e dell'evoluzione in corso di prodotti fenilpropanoidi specializzati e sottolineano le basi molecolari della biodiversità metabolica a livello chimico. Infine, la conoscenza dettagliata della struttura, della funzione e dell'evoluzione di questi enzimi del metabolismo specializzato fornisce una serie di modelli sperimentali per l'ingegneria enzimatica e metabolica di piattaforme di produzione per diversi nuovi composti con proprietà dietetiche e medicinali desiderabili.

Zhao, N., Ferrer, JL, Ross, J., Guan, J., Yang, Y., Pichersky, E., Noel, JP, Chen, F. Analisi strutturali, biochimiche e filogenetiche suggeriscono che l'indolo-3-acetico metiltransferasi è un membro evolutivamente antico della famiglia SABATH. (2008) Fisiologia vegetale. 146(2):455-67. DOI: 10.1104/pp.107.110049

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La famiglia proteica SABATH vegetale comprende un gruppo di metiltransferasi (MT) a piccole molecole correlate che catalizzano la metilazione dipendente da S-adenosil-L-metionina di sostanze chimiche naturali con strutture ampiamente divergenti. L'acido indolo-3-acetico (IAA) metiltransferasi (IAMT) è un membro della famiglia SABATH che modula l'omeostasi dell'IAA nei tessuti vegetali attraverso la metilazione del gruppo carbossilico libero dell'IAA. La struttura cristallina dell'IAMT (AtIAMT1) di Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) è stata determinata e raffinata con una risoluzione di 2.75 Å. Le strutture terziarie e quaternarie complessive assomigliano molto rispettivamente al monomero bilobato a due domini e alla disposizione dimerica, precedentemente osservati per la carbossil metiltransferasi dell'acido salicilico correlata di Clarkia breweri (CbSAMT). Per approfondire la nostra comprensione della funzione biologica e dell'evoluzione dei SABATH, in particolare dell'IAMT, abbiamo analizzato la famiglia genica SABATH nel genoma del riso (Oryza sativa). Sono stati identificati quarantuno geni OsSABATH. L'analisi di espressione ha mostrato che più della metà dei geni OsSABATH era trascritta in uno o più organi. Il gene OsSABATH più simile ad AtIAMT1 è OsSABATH4. La proteina OsSABATH4 espressa in Escherichia coli ha mostrato il più alto livello di attività catalitica verso l'IAA ed è stata quindi denominata OsIAMT1. OsIAMT1 ha mostrato proprietà cinetiche simili ad AtIAMT1 e all'IAMT del pioppo (PtIAMT1). La modellazione strutturale di OsIAMT1 e PtIAMT1, utilizzando la struttura di AtIAMT1 determinata sperimentalmente e riportata qui come modello, ha rivelato caratteristiche strutturali conservate degli IAMT all'interno della cavità del sito attivo che sono divergenti da membri funzionalmente distinti della famiglia SABATH, come CbSAMT. L'analisi filogenetica ha rivelato che gli IAMT di Arabidopsis, riso e pioppo (Populus spp.) formano un gruppo monofiletico. Pertanto, evidenze strutturali, biochimiche e filogenetiche supportano l'ipotesi che l'IAMT sia un membro evolutivamente antico della famiglia SABATH, che probabilmente svolge un ruolo critico nell'omeostasi degli IAA in un'ampia gamma di piante.

Eustaquio, AS, Pojer, F., Noel, JP, Moore, BS Scoperta e caratterizzazione di una clorinasi batterica marina dipendente da SAM. (2008) Biologia chimica della natura. 4(1):69-74. DOI: 10.1038/nchembio.2007.56

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Noel, JP Cercare risposte, annusare un barlume di successo e assaporare il trionfo. (2007) Biologia chimica della natura. 3(11):690-1. DOI: 10.1038/nchembio1107-690

Louie, GV, Baiga, TJ, Bowman, ME, Koeduka, T., Taylor, JH, Spassova, SM, Pichersky, E., Noel, JP Struttura e meccanismo di reazione della sintasi dell'eugenolo del basilico. (2007) PLOS One. 2(10):e993. DOI: 10.1371/journal.pone.0000993

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I fenilpropeni, un ampio gruppo di composti volatili vegetali che svolgono molteplici ruoli nella difesa e nell'attrazione degli impollinatori, contengono una catena laterale propenilica. L'eugenolo sintasi (EGS) catalizza lo spostamento riduttivo dell'acetato dalla catena laterale propenilica del substrato acetato di coniferile per produrre l'allil-fenilpropene eugenolo. Riportiamo qui la determinazione della struttura dell'EGS del basilico (Ocimum basilicum) mediante cristallografia a raggi X delle proteine. L'EGS è strutturalmente correlato alle deidrogenasi/reduttasi a catena corta (SDR) e, in particolare, agli enzimi della sottofamiglia isoflavone-reduttasi-simili. La struttura di un complesso ternario di EGS legato al cofattore NADP(H) e a un inibitore competitivo misto EMDF ((7S,8S)-etil (7,8-metilene)-diidroferulato) fornisce una visione dettagliata delle interazioni di legame all'interno del sito attivo di EGS e un punto di partenza per l'esame mutageno dell'insolito meccanismo riduttivo di EGS. Le interazioni chiave tra EMDF e l'oloenzima EGS includono l'impilamento dell'anello fenilico di EMDF contro l'anello nicotinamide del cofattore e un'interazione di legame a idrogeno mediata dall'acqua tra il gruppo 4-idrossilico di EMDF e la porzione amminica della catena laterale di un residuo di lisina conservato, Lys132. Il carbonio C4 della nicotinamide risiede immediatamente adiacente al sito di aggiunta dell'idruro, il carbonio C7 dei substrati di acetato di cinnamile. La struttura dell'EGS legata all'inibitore suggerisce un meccanismo di reazione a due stadi che prevede la formazione di un chinone-metide prima della riduzione. La formazione di questo intermedio è promossa da una rete di legami a idrogeno che favorisce la deprotonazione del gruppo 4-idrossilico del substrato e sfavorisce il legame della porzione acetato, in modo simile a un meccanismo catalitico push-pull. In particolare, il coinvolgimento catalitico nell'EGS della Lys132 conservata nella preparazione del substrato fenolico per la formazione del chinone-metide attraverso la rete di relè protonici sembra essere un adattamento dell'analogo ruolo nella formazione di legami a idrogeno svolto dal residuo di lisina equivalente in altri enzimi della famiglia SDR.

Faraldos, JA, Zhao, Y., O'Maille, PE, Noel, JP, Coates, RM Intercettazione della conversione enzimatica del farnesil difosfato in 5-epi-aristolochene mediante l'uso di un analogo del substrato fluorurato: 1-fluorogermacrene A da (2E,6Z)-6-fluorofarnesil difosfato. (2007) Chembiochimica. 8(15):1826-33. DOI: 10.1002/cbic.200700398

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Takahashi, S., Yeo, YS, Zhao, Y., O'Maille, PE, Greenhagen, BT, Noel, JP, Coates, RM, Chappell, J. Caratterizzazione funzionale della premnaspirodiene ossigenasi, un citocromo P450 che catalizza idrossilazioni regio- e stereo-specifiche di diversi substrati sesquiterpenici. (2007) Rivista di chimica biologica. 282(43):31744-54. DOI: 10.1074/jbc.M703378200

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Wang, W., Takimoto, JK, Louie, GV, Baiga, TJ, Noel, JP, Lee, KF, Slesinger, PA, Wang, L. Codifica genetica di amminoacidi non naturali per studi cellulari e neuronali. (2007) Nature Neuroscience. 10(8):1063-72. DOI: 10.1038/nn1932

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Haagen, Y., Unsöld, I., Westrich, L., Gust, B., Richard, SB, Noel, JP, Heide, L. Una preniltransferasi solubile e indipendente dal magnesio catalizza le C-prenilazioni inverse e regolari e le O-prenilazioni dei substrati aromatici. (2007) FEBS Lettere. 581(16):2889-93. DOI: 10.1016/j.febslet.2007.05.031

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Zhang, Y., Daum, S., Wildemann, D., Zhou, XZ, Verdecia, MA, Bowman, ME, Lücke, C., Hunter, T., Lu, KP, Fischer, G., Noel, JP Basi strutturali per l'inibizione peptidica ad alta affinità del Pin1 umano. (2007) Biologia chimica ACS. 2(5):320-8. DOI: 10.1021/cb7000044

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Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, BT, McMullin, T., Song, L., Maurina-Brunker, J., Rosson, R., Noel, JP, Chappell, J. Ingegneria metabolica del metabolismo dei sesquiterpeni nel lievito. (2007) Biotecnologia e bioingegneria. 97(1):170-81. DOI: 10.1002/bit.21216

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Moffitt, MC, Louie, GV, Bowman, ME, Pence, J., Noel, JP, Moore, BS Scoperta di due fenilalanina ammoniaca liasi cianobatteriche: caratterizzazione cinetica e strutturale. (2007) Biochimica. 46(4):1004-12. DOI: 10.1021/bi061774g

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Varbanova, M., Yamaguchi, S., Yang, Y., McKelvey, K., Hanada, A., Borochov, R., Yu, F., Jikumaru, Y., Ross, J., Cortes, D., Ma, CJ, Noel, JP, Mander, L., Shulaev, V., Kamiya, Y., Rodermel, S., Weiss, D., Pichersky, E. Metilazione delle gibberelline da parte di Arabidopsis GAMT1 e GAMT2. (2007) Cellula vegetale. 19(1):32-45. DOI: 10.1105/tpc.106.044602

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Louie, GV, Bowman, ME, Moffitt, MC, Baiga, TJ, Moore, BS, Noel, JP Determinanti strutturali e modulazione della specificità del substrato nelle fenilalanina-tirosina ammoniaca-liasi. (2006) Chimica e biologia. 13(12):1327-38. DOI: 10.1016/j.chembiol.2006.11.011

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Liu, CJ, Deavours, BE, Richard, SB, Ferrer, JL, Blount, JW, Huhman, D., Dixon, RA, Noel, JP Basi strutturali della doppia funzionalità delle isoflavonoidi O-metiltransferasi nell'evoluzione delle risposte di difesa delle piante. (2006) Cellula vegetale. 18(12):3656-69. DOI: 10.1105/tpc.106.041376

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Zhang, Y., Kim, Y., Genoud, N., Gao, J., Kelly, JW, Pfaff, SL, Gill, GN, Dixon, JE, Noel, JP Determinanti per la defosforilazione del dominio C-terminale dell'RNA polimerasi II da parte di Scp1. (2006) Cellula molecolare. 24(5):759-70. DOI: 10.1016/j.molcel.2006.10.027

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Ferrer, JL, Dupuy, J., Borel, F., Jacquamet, L., Noel, JP, Dulic, V. Basi strutturali per la modulazione dell'attività dipendente/indipendente da CDK della ciclina D1. (2006) Ciclo cellulare. 5(23):2760-8. DOI: 10.4161/cc.5.23.3506

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Song, L., Barona-Gomez, F., Corre, C., Xiang, L., Udwary, DW, Austin, MB, Noel, JP, Moore, BS, Challis, GL Scoperta tramite l'analisi del genoma di Streptomyces coelicolor dell'unità di avviamento della polichetide sintasi di tipo III beta-chetoacil-ACP e della selettività dell'unità di estensione dell'etilmalonil-CoA. (2006) Giornale della Società chimica americana. 128(46):14754-5. DOI: 10.1021/ja065247w

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Deavours, BE, Liu, CJ, Naoumkina, MA, Tang, Y., Farag, MA, Sumner, LW, Noel, JP, Dixon, RA Analisi funzionale dei membri delle famiglie di enzimi isoflavone e isoflavanone O-metiltransferasi del legume modello Medicago truncatula. (2006) Biologia molecolare vegetale. 62(4-5):715-33. DOI: 10.1007/s11103-006-9050-x

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Austin, MB, Saito, T., Bowman, ME, Haydock, S., Kato, A., Moore, BS, Kay, RR, Noel, JP Biosintesi del fattore di induzione della differenziazione di Dictyostelium discoideum mediante una sintasi ibrida di acido grasso di tipo I e polichetide di tipo III. (2006) Biologia chimica della natura. 2(9):494-502. DOI: 10.1038/nchembio811

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Pojer, F., Ferrer, JL, Richard, SB, Nagegowda, DA, Chye, ML, Bach, TJ, Noel, JP Basi strutturali per la progettazione di inibitori potenti e specie-specifici delle 3-idrossi-3-metilglutaril CoA sintasi. (2006) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103(31):11491-6. DOI: 10.1073/pnas.0604935103

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Jäger, M., Zhang, Y., Bieschke, J., Nguyen, H., Dendle, M., Bowman, ME, Noel, JP, Gruebele, M., Kelly, JW Relazione struttura-funzione-piegatura in un dominio WW. (2006) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103(28):10648-53. DOI: 10.1073/pnas.0600511103

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Greenhagen, BT, O'Maille, PE, Noel, JP, Chappell, J. Identificazione e manipolazione dei determinanti strutturali che collegano le specificità catalitiche nelle sintasi dei terpeni. (2006) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103(26):9826-31. DOI: 10.1073/pnas.0601605103

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Koeduka, T., Fridman, E., Gang, DR, Vassão, DG, Jackson, BL, Kish, CM, Orlova, I., Spassova, SM, Lewis, NG, Noel, JP, Baiga, TJ, Dudareva, N., Pichersky, E. L'eugenolo e l'isoeugenolo, costituenti aromatici caratteristici delle spezie, vengono biosintetizzati tramite la riduzione di un estere alcolico coniferilico. (2006) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103(26):10128-33. DOI: 10.1073/pnas.0603732103

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O'Maille, PE, Chappell, J., Noel, JP Potenziale biosintetico delle sesquiterpene sintasi: prodotti alternativi della 5-epi-aristolochene sintasi del tabacco. (2006) Archivi di biochimica e biofisica. 448(1-2):73-82. DOI: 10.1016/j.abb.2005.10.028

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Coiner, H., Schröder, G., Wehinger, E., Liu, CJ, Noel, JP, Schwab, W., Schröder, J. Metilazione dei gruppi sulfidrilici: una nuova funzione per una famiglia di O-metiltransferasi vegetali a piccole molecole. (2006) Rivista di piante. 46(2):193-205. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2006.02680.x

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Nelle piante, le O-metiltransferasi (OMT) dipendenti dalla S-adenosil-l-metionina di tipo I e II catalizzano la maggior parte delle metilazioni del gruppo ossidrilico di piccole molecole. Una strategia di RT-PCR basata sull'omologia, che utilizza l'RNA di Catharanthus roseus (pervinca del Madagascar), ha precedentemente identificato sei nuovi membri della famiglia OMT di tipo I nelle piante. Descriviamo ora la caratterizzazione molecolare e biochimica di una settima proteina. Condivide il 56-58% di identità con le OMT dell'acido caffeico (COMT), ma non è riuscita a metilare i substrati COMT e non ha mostrato attività con i flavonoidi. Tuttavia, le incubazioni in vitro hanno rivelato livelli di fondo insolitamente elevati senza substrati aggiunti. Una ricerca del componente responsabile ha rivelato che l'enzima metilava il ditiotreitolo (DTT), l'agente riducente aggiunto per la stabilizzazione enzimatica. Inaspettatamente, l'analisi del prodotto ha rivelato che la metilazione si è verificata su una porzione sulfidrilica, non su un gruppo ossidrilico. L'analisi di 34 composti ha indicato un'ampia gamma di substrati, con una preferenza per le piccole molecole idrofobiche. Il benzene tiolo (Km 220 micron) e il furfuril tiolo (Km 60 micron) sono risultati i substrati migliori (6-7 volte migliori del DTT). Anche piccoli substrati idrofobici isosterici con gruppi ossidrilici, come fenolo e guaiacolo, sono stati metilati, ma le attività erano almeno 5 volte inferiori rispetto ai tioli. L'enzima è stato denominato C. roseus S-metiltransferasi 1 (CrSMT1). Modelli basati sulla struttura cristallina del COMT suggeriscono che la S-metilazione sia meccanicisticamente identica alla O-metilazione. CrSMT1 è finora l'unico esempio riconosciuto di S-metiltransferasi in questa famiglia di proteine. Le sue proprietà indicano che poche modifiche nei residui chiave sono sufficienti per convertire una OMT in una S-metiltransferasi (SMT). Le future indagini funzionali sulle metiltransferasi vegetali dovrebbero prendere in considerazione la possibilità che gli enzimi possano dirigere la metilazione sui gruppi sulfidrilici.

Schenk, DJ, Starks, CM, Manna, KR, Chappell, J., Noel, JP, Coates, RM Effetti stereochimici ed isotopici del deuterio associati ai riarrangiamenti di ciclizzazione catalizzati dalle sintasi dell'epiaristolochene del tabacco e del premnaspirodiene dell'iosciamo, e dall'ibrido chimerico CH4 (2006) Archivi di biochimica e biofisica. 448(1-2):31-44. DOI: 10.1016/j.abb.2005.09.002

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Le sintasi dell'epiaristolochene del tabacco e del premnaspirodiene di iosciamo (TEAS e HPS) catalizzano le ciclizzazioni e i riarrangiamenti del (E,E)-farnesil difosfato (FPP) nei corrispondenti idrocarburi sesquiterpenici biciclici. Il complesso meccanismo avviene attraverso un intermedio A (R)-germacrene strettamente legato e prevede la partizione di un comune carbocatione eudesm-5-ilico mediante migrazione angolare del metile o mediante riarrangiamento metilenico in C-9, per formare le rispettive strutture dell'eremofilano e dello spirovetivano. In questo lavoro, la stereochimica e la tempistica delle fasi di addizione ed eliminazione protonica nel meccanismo sono state studiate mediante sintesi di substrati recanti marcatori di deuterio in uno o entrambi i gruppi metilici terminali e negli idrogeni metilenici pro-S e pro-R in C-8. Le incubazioni degli FPP marcati con TEAS e HPS ricombinanti e con l'ibrido ciclasi CH4 chimerico avente attività catalitiche sia di TEAS che di HPS e di FPP non marcato in D2O, insieme alle analisi di cromatografia di massa-spettrometria di massa (GC-MS) e/o NMR dei prodotti marcati hanno dato i seguenti risultati: (1) eliminazioni stereospecifiche CH3-->CH2 al metile cis-terminale in tutti i casi; (2) effetti isotopici cinetici primari (KIE) simili di 4.25-4.64 per le eliminazioni CH3-->CH2; (3) un KIE intermolecolare significativo (1.33+/-0.03) nelle ciclizzazioni competitive di FPP non marcato e FPP-d6 a premnaspirodiene mediante HPS; (4) incorporazione stereoselettiva del marcatore da D2O nella posizione 1beta dell'epiaristolochene; (5) eliminazioni stereoselettive dei protoni 1β e 9β nella formazione dell'epiaristolochene e del suo isomero delta(1(10)) epieremofilene da parte di TEAS e CH4; e (6) perdita predominante del protone 1α nella formazione del doppio legame cicloesenico del premnaspirodiene da parte di HPS e CH4. I risultati sono spiegati considerando le conformazioni dei singoli intermedi e imponendo il requisito di addizioni ed eliminazioni protoniche stereoelettronicamente favorevoli.

Yang, Y., Yuan, JS, Ross, J., Noel, JP, Pichersky, E., Chen, F. Una metiltransferasi di Arabidopsis thaliana in grado di metilare l'acido farnesoico. (2006) Archivi di biochimica e biofisica. 448(1-2):123-32. DOI: 10.1016/j.abb.2005.08.006

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Lherbet, C., Pojer, F., Richard, SB, Noel, JP, Poulter, CD Assenza di canalizzazione del substrato tra i siti attivi negli enzimi IspDF e IspE di Agrobacterium tumefaciens del percorso del metileritritolo fosfato. (2006) Biochimica. 45(11):3548-53. DOI: 10.1021/bi0520075

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Pichersky, E., Noel, JP, Dudareva, N. Biosintesi delle sostanze volatili delle piante: diversità e ingegnosità della natura. (2006) Scienza. 311(5762):808-11. DOI: 10.1126/science.1118510

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Testa, CA, Lherbet, C., Pojer, F., Noel, JP, Poulter, CD Clonazione ed espressione di IspDF da Mesorhizobium loti. Caratterizzazione di una proteina bifunzionale che catalizza passaggi non consecutivi nella via del metileritritolo fosfato. (2006) Biochimica et Biofisica Acta. 1764(1):85-96. DOI: 10.1016/j.bbapap.2005.08.006

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Verdecia, MA, Larkin, RM, Ferrer, JL, Riek, R., Chory, J., Noel, JP [La struttura del cofattore Mg-chelatasi GUN4 rivela una nuova piega a forma di mano per il legame della porfirina]. (2005) Scienze Mediche (Parigi). 21(11):903-4. DOI: 10.1051/medsci/20052111903

Bomati, EK, Austin, MB, Bowman, ME, Dixon, RA, Noel, JP Chiarimento strutturale della calcone reduttasi e implicazioni per la biosintesi dei desossicalconi. (2005) Rivista di chimica biologica. 280(34):30496-503. DOI: 10.1074/jbc.M502239200

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Il 4,2',4',6'-tetraidrossicalcone (calcone) e il 4,2',4'-triidrossicalcone (desossicalcone) fungono da precursori di flavonoidi e isoflavonoidi di importanza ecologica. La formazione del desossicalcone dipende dalla calcone sintasi e dalla calcone reduttasi; tuttavia, l'identità del substrato della calcone reduttasi tra i possibili substrati formati durante la reazione multifase catalizzata dalla calcone sintasi rimane sperimentalmente elusiva. In questo articolo riportiamo la struttura tridimensionale della calcone reduttasi dell'erba medica legata al cofattore NADP+ e proponiamo l'identità e la modalità di legame del suo substrato, ovvero l'intermedio cumaril-trione non aromatizzato della ciclizzazione catalizzata dalla calcone sintasi dell'intermedio tioestere cumaril-tetrachetide completamente esteso. In assenza di un complesso ternario, la qualità della struttura raffinata della calcone reduttasi legata al NADP+ funge da modello per il docking assistito da computer per valutare la probabilità di possibili substrati. È interessante notare che la calcone reduttasi adotta la struttura tridimensionale della superfamiglia delle aldo/cheto reduttasi. La struttura della aldo/cheto reduttasi è strutturalmente distinta da tutte le chetoreduttasi note per la biosintesi degli acidi grassi, che appartengono invece alla superfamiglia delle deidrogenasi/reduttasi a catena corta. I risultati presentati qui forniscono supporto strutturale all'evoluzione funzionale convergente di queste due chetoreduttasi che condividono ruoli simili nella biosintesi degli acidi grassi/polichetidi. Inoltre, la struttura della calcone reduttasi rappresenta la prima struttura proteica di un membro della famiglia delle aldo/chetoreduttasi 4. Pertanto, la struttura della calcone reduttasi funge da modello per la modellazione dell'omologia di altri membri della famiglia aldo/cheto-reduttasi 4, tra cui la reduttasi coinvolta nella biosintesi della morfina, ovvero la codeinone reduttasi.

Kuzuyama, T., Noel, JP, Richard, SB Basi strutturali per la prenilazione biosintetica promiscua di prodotti naturali aromatici. (2005) Natura. 435(7044):983-7. DOI: 10.1038/natura03668

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Noel, JP, Austin, MB, Bomati, EK Relazioni struttura-funzione nella biosintesi dei fenilpropanoidi nelle piante. (2005) Opinione attuale in biologia vegetale. 8(3):249-53. DOI: 10.1016/j.pbi.2005.03.013

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Effmert, U., Saschenbrecker, S., Ross, J., Negre, F., Fraser, CM, Noel, JP, Dudareva, N., Piechulla, B. Metiltransferasi benzenoidi floreali: dalla funzione in vitro a quella in pianta. (2005) Fitochimica. 66(11):1211-30. DOI: 10.1016/j.phytochem.2005.03.031

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Le carbossimetiltransferasi benzenoidi sintetizzano esteri metilici (ad esempio, metil benzoato e metil salicilato), che sono costituenti di aromi e profumi di molte specie vegetali e svolgono un ruolo importante nella comunicazione delle piante con l'ambiente circostante. Negli ultimi cinque anni, sono state isolate undici di queste carbossimetiltransferasi e la maggior parte di esse è stata studiata in modo approfondito a livello biochimico, molecolare e strutturale. Si possono distinguere due tipi di enzimi in base alle loro preferenze di substrato: gli enzimi di tipo SAMT isolati da Clarkia breweri, Stephanotis floribunda, Antirrhinum majus, Hoya carnosa e Petunia hybrida, che hanno una maggiore efficienza catalitica e una preferenza per l'acido salicilico, mentre gli enzimi di tipo BAMT isolati da A. majus, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata e Nicotiana suaveolens preferiscono l'acido benzoico. La spiegazione della struttura tridimensionale della SAMT di C. breweri ha permesso una modellazione dettagliata dei siti attivi delle carbossil metiltransferasi e ha rivelato che la tasca di legame SAM è altamente conservata tra questi enzimi, mentre il sito di legame dell'accettore metilico mostra una certa variabilità, consentendo una classificazione in enzimi di tipo SAMT e di tipo BAMT. L'analisi dei pattern di espressione, abbinata alla caratterizzazione biochimica, ha mostrato che queste carbossil metiltransferasi sono coinvolte sia nella biosintesi delle fragranze floreali sia nelle risposte di difesa delle piante. Mentre queste ultime possono essere indotte da stress biotico o abiotico, i geni responsabili della sintesi delle fragranze floreali mostrano un pattern di espressione ritmico e di sviluppo. La natura del prodotto e l'efficienza della sua formazione in pianta dipendono dalla disponibilità di substrati, dall'efficienza catalitica dell'enzima nei confronti dell'acido benzoico e/o dell'acido salicilico e dalla regolazione trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale a livello enzimatico. Le proprietà biochimiche delle benzenoidi carbossimetiltransferasi suggeriscono che i geni coinvolti nelle difese delle piante potrebbero rappresentare gli antenati degli attuali geni floreali che, durante l'evoluzione, hanno acquisito diversi profili di espressione e codificato enzimi con la capacità di accettare substrati strutturalmente simili.

Verdecia, MA, Larkin, RM, Ferrer, JL, Riek, R., Chory, J., Noel, JP La struttura del cofattore Mg-chelatasi GUN4 rivela una nuova piega a forma di mano per il legame della porfirina. (2005) PLOS Biology. 3(5):e151. DOI: 10.1371/journal.pbio.0030151

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Bomati, EK, Noel, JP Basi strutturali e cinetiche per la selettività del substrato nella sinapila alcol deidrogenasi di Populus tremuloides. (2005) Cellula vegetale. 17(5):1598-611. DOI: 10.1105/tpc.104.029983

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Ferrer, JL, Zubieta, C., Dixon, RA, Noel, JP Strutture cristalline del caffeoil coenzima A 3-O-metiltransferasi dell'erba medica. (2005) Fisiologia vegetale. 137(3):1009-17. DOI: 10.1104/pp.104.048751

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Takahashi, S., Zhao, Y., O'Maille, PE, Greenhagen, BT, Noel, JP, Coates, RM, Chappell, J. Analisi cinetica e molecolare della 5-epiaristolochene 1,3-diidrossilasi, un enzima del citocromo P450 che catalizza successive idrossilazioni dei sesquiterpeni. (2005) Rivista di chimica biologica. 280(5):3686-96. DOI: 10.1074/jbc.M411870200

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La fase finale della biosintesi del capsidiolo è catalizzata dalla 5-epiaristolochene diidrossilasi (EAH), un enzima del citocromo P450 che catalizza l'inserimento regio- e stereospecifico di due gruppi idrossilici nel sesquiterpene biciclico 5-epiaristolochene (EA). Studi cinetici dettagliati che utilizzano EA e i due possibili intermedi monoidrossilati hanno dimostrato il rilascio di 1β-idrossi-EA ((OH)EA) ad alte concentrazioni di EA e una preferenza catalitica 10 volte superiore per 1β(OH)EA rispetto a 3α(OH)EA, indicativa di un ordine di reazione preferito di idrossilazione in C-1, seguito da quello in C-3. Gli allineamenti di sequenza e la modellazione di omologia hanno identificato i residui del sito attivo testati per il loro contributo alla specificità del substrato e all'attività enzimatica complessiva. I mutanti EAH-S368C ed EAH-S368V hanno mostrato efficienze catalitiche di tipo selvatico per la biosintesi di 1β(OH)EA, ma erano privi dell'attività di idrossilazione successiva per la biosintesi del capsidiolo. A differenza di EAH-S368C, EAH-S368V catalizzava la biosintesi relativamente uguale di 1β(OH)EA, 2β(OH)EA e 3β(OH)EA da EA con efficienza di tipo selvatico. Inoltre, EAH-S368V convertiva circa l'1.5% di questi prodotti monoidrossilati nelle rispettive forme chetoniche. Le mutazioni di alanina e treonina in posizione 368 erano significativamente compromesse nei loro tassi di conversione di EA in capsidiolo e correlate con aumenti di 3.6 e 5.7 volte nei loro valori di Km per l'intermedio 1β(OH)EA, rispettivamente. Un ruolo di Ile486 nelle successive idrossilazioni di EA è stato suggerito anche dal mutante EAH-I468A, che produceva quantità significative di 1β(OH)EA, ma quantità trascurabili di capsidiolo da EA. Il profilo di prodotto alterato del mutante EAH-I486A era correlato a una Km 3.6 volte più elevata per EA e a un tasso di turnover (kcat) 4.4 volte più lento per 1β(OH)EA. Questi studi cinetici e mutazionali sono stati correlati con le previsioni di docking del substrato per suggerire come Ser368 e Ile486 potrebbero contribuire alla topologia del sito attivo, al legame del substrato e alla presentazione del substrato al centro di reazione oxo-Fe-eme.

O'Maille, PE, Chappell, J., Noel, JP Un saggio analitico e quantitativo di gascromatografia-spettrometria di massa a fiala singola per le sintasi dei terpeni. (2004) Biochimica analitica. 335(2):210-7. DOI: 10.1016/j.ab.2004.09.011

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Austin, MB, Izumikawa, M., Bowman, ME, Udwary, DW, Ferrer, JL, Moore, BS, Noel, JP Struttura cristallina di una polichetide sintasi batterica di tipo III e controllo enzimatico degli intermedi polichetidici reattivi. (2004) Rivista di chimica biologica. 279(43):45162-74. DOI: 10.1074/jbc.M406567200

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Nei batteri, una polichetide sintasi di tipo III (PKS) strutturalmente semplice, nota come 1,3,6,8-tetraidrossinaftlene sintasi (THNS), catalizza la condensazione iterativa di cinque unità maloniliche legate al CoA per formare un intermedio pentaketide. La THNS catalizza successivamente una duplice condensazione intramolecolare di Claisen e una condensazione aldolica di questo intermedio lineare per produrre lo scheletro tetraidrossinaftalenico (THN) ad anello fuso. Il meccanismo di estensione del polichetide catalizzato dalla PKS di tipo III, che utilizza una triade catalitica conservata Cys-His-Asn in una cavità interna del sito attivo, è abbastanza ben compreso. Tuttavia, la base meccanicistica dell'insolita produzione di THN e della duplice ciclizzazione del suo pentaketide innescato dal malonile è oscura. In questo articolo presentiamo la prima struttura cristallina di PKS batterica di tipo III, quella di Streptomyces coelicolor THNS, e identifichiamo, tramite mutagenesi, modellazione strutturale e analisi chimica, l'inaspettata partecipazione catalitica di un ulteriore residuo di cisteina conservato in THNS nel facilitare l'estensione del polichetide innescato con malonile oltre lo stadio trichetidico. Il nuovo modello meccanicistico risultante, che prevede l'uso di cisteine aggiuntive per alterare e guidare la reattività del polichetide, può essere generalmente applicato ad altri meccanismi di reazione PKS, inclusi quelli catalizzati da enzimi PKS iterativi di tipo I e II. La nostra struttura cristallina rivela anche una nuova cavità inaspettata che si estende nel "pavimento" della cavità del sito attivo tradizionale, fornendo la prima plausibile spiegazione strutturale e meccanicistica per un'altra insolita attività catalitica THNS: il suo ulteriore passaggio di estensione del polichetide, precedentemente inspiegabile, quando innescato con uno starter acilico lungo. Questo tunnel consente l'espansione selettiva del volume della cavità del sito attivo disponibile mediante il sequestro delle code di polichetidi derivati da starter alifatici e suggerisce inoltre un altro meccanismo di protezione distinto che coinvolge il mantenimento di una conformazione lineare del polichetidi.

Austin, MB, Bowman, ME, Ferrer, JL, Schröder, J., Noel, JP Un interruttore aldolico scoperto nelle stilbene sintasi media la specificità della ciclizzazione delle polichetide sintasi di tipo III. (2004) Chimica e biologia. 11(9):1179-94. DOI: 10.1016/j.chembiol.2004.05.024

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Richard, SB, Lillo, AM, Tetzlaff, CN, Bowman, ME, Noel, JP, Cane, DE L'analisi cinetica della 2-C-metil-D-eritritolo-4-fosfato citidiltransferasi di Escherichia coli, di tipo selvatico e mutante, rivela il ruolo degli amminoacidi del sito attivo. (2004) Biochimica. 43(38):12189-97. DOI: 10.1021/bi0487241

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Pott, MB, Hippauf, F., Saschenbrecker, S., Chen, F., Ross, J., Kiefer, I., Slusarenko, A., Noel, JP, Pichersky, E., Effmert, U., Piechulla, B. Caratterizzazione biochimica e strutturale delle benzenoidi carbossil metiltransferasi coinvolte nella produzione di profumi floreali in Stephanotis floribunda e Nicotiana suaveolens. (2004) Fisiologia vegetale. 135(4):1946-55. DOI: 10.1104/pp.104.041806

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Hendricks, CL, Ross, JR, Pichersky, E., Noel, JP, Zhou, ZS Un test colorimetrico accoppiato a enzimi per le metiltransferasi dipendenti da S-adenosilmetionina. (2004) Biochimica analitica. 326(1):100-5. DOI: 10.1016/j.ab.2003.11.014

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O'Maille, PE, Tsai, MD, Greenhagen, BT, Chappell, J., Noel, JP Sintesi di librerie geniche mediante ingegneria proteica combinatoria basata sulla struttura. (2004) Metanfetamina Enzimol. 388:75-91. DOI: 10.1016/S0076-6879(04)88008-X

Chen, F., D'Auria, JC, Tholl, D., Ross, JR, Gershenzon, J., Noel, JP, Pichersky, E. Un gene di Arabidopsis thaliana per la biosintesi del metilsalicilato, identificato mediante un approccio genomico biochimico, ha un ruolo nella difesa. (2003) Rivista di piante. 36 (5): 577-88.

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Zubieta, C., Ross, JR, Koscheski, P., Yang, Y., Pichersky, E., Noel, JP Basi strutturali per il riconoscimento del substrato nella famiglia delle carbossimetiltransferasi dell'acido salicilico. (2003) Cellula vegetale. 15 (8): 1704-16.

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Recentemente, è stata identificata nelle piante una nuova famiglia di metiltransferasi. Alcuni membri di questa famiglia di metiltransferasi, recentemente scoperta e caratterizzata, catalizzano la formazione di esteri metilici a piccole molecole utilizzando S-adenosil-L-Met (SAM) come donatore di metile e substrati contenenti acidi carbossilici come accettori di metile. Questi enzimi includono SAMT (SAM: carbossil metiltransferasi dell'acido salicilico), BAMT (SAM: carbossil metiltransferasi dell'acido benzoico) e JMT (SAM: carbossil metiltransferasi dell'acido jasmonico). Inoltre, è stato scoperto che altri membri di questa famiglia di metiltransferasi vegetali catalizzano la N-metilazione dei precursori della caffeina. La struttura cristallina 3.0-A della SAMT di Clarkia breweri in complesso con il substrato acido salicilico e il prodotto demetilato S-adenosil-L-omocisteina rivela una struttura proteica che possiede un dominio di capping elicoidale del sito attivo e un'interfaccia di dimerizzazione unica. Inoltre, i determinanti chimici responsabili della selezione dell'acido salicilico dimostrano la base strutturale per facili variazioni di selettività del substrato tra metiltransferasi vegetali funzionalmente caratterizzate, dirette verso il carbossile e verso l'azoto, e un crescente insieme di proteine correlate che devono ancora essere esaminate biochimicamente. Utilizzando la struttura tridimensionale della SAMT come guida, abbiamo esaminato la specificità del substrato della SAMT mediante mutagenesi sito-diretta e saggi di attività contro 12 piccole molecole contenenti carbossile. Inoltre, l'utilità delle informazioni strutturali per la caratterizzazione funzionale di questa grande famiglia di metiltransferasi vegetali è stata dimostrata dalla scoperta di una metiltransferasi di Arabidopsis specifica per l'acido indolo-3-acetico, un fitormone contenente carbossile.

Izumikawa, M., Shipley, PR, Hopke, JN, O'Hare, T., Xiang, L., Noel, JP, Moore, BS Espressione e caratterizzazione della polichetide sintasi di tipo III 1,3,6,8-tetraidrossinaftalene sintasi da Streptomyces coelicolor A3(2). (2003) Rivista di microbiologia industriale e biotecnologia. 30(8):510-5. DOI: 10.1007/s10295-003-0075-8

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Sonnenburg, ED, Bilwes, A., Hunter, T., Noel, JP La struttura del dominio della fosfatasi distale della membrana di RPTPalpha rivela flessibilità interdominio e una regione di interazione del dominio SH2. (2003) Biochimica. 42(26):7904-14. DOI: 10.1021/bi0340503

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Downes, M., Verdecia, MA, Roecker, AJ, Hughes, R., Hogenesch, JB, Kast-Woelbern, HR, Bowman, ME, Ferrer, JL, Anisfeld, AM, Edwards, PA, Rosenfeld, JM, Alvarez, JG, Noel, JP, Nicolaou, KC, Evans, RM Analisi chimica, genetica e strutturale del recettore nucleare degli acidi biliari FXR. (2003) Cellula molecolare. 11 (4): 1079-92.

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Austin, MB, Noel, JP La superfamiglia delle calcone sintasi delle polichetidi sintasi di tipo III. (2003) Rapporti sui prodotti naturali. 20 (1): 79-110.

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Verdecia, MA, Joazeiro, CA, Wells, NJ, Ferrer, JL, Bowman, ME, Hunter, T., Noel, JP La flessibilità conformazionale è alla base della legatura dell'ubiquitina mediata dalla ligasi E1 del dominio HECT WWP3. (2003) Cellula molecolare. 11 (1): 249-59.

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Moore, BS, Hertweck, C., Hopke, JN, Izumikawa, M., Kalaitzis, JA, Nilsen, G., O'Hare, T., Piel, J., Shipley, PR, Xiang, L., Austin, MB, Noel, JP Percorsi biosintetici simili a quelli delle piante nei batteri: dall'acido benzoico al calcone. (2002) Giornale di prodotti naturali. 65(12):1956-62. DOI: 10.1021/np020230m

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Sebbene fenilpropanoidi e flavonoidi siano prodotti naturali comuni nelle piante, queste principali classi di metaboliti secondari biologicamente attivi sono in gran parte assenti nei batteri. Gli enzimi vegetali ubiquitari fenilalanina ammoniaca liasi (PAL) e calcone sintasi (CHS) sono catalizzatori biosintetici chiave rispettivamente nell'assemblaggio di fenilpropanoidi e flavonoidi. Fino a poco tempo fa, erano note poche controparti batteriche, riflettendo così la scarsità di questi prodotti naturali vegetali nei batteri. Questa revisione evidenzia i nostri progressi nella caratterizzazione biochimica e genetica delle vie biosintetiche degli streptomiceti recentemente identificate per l'acido benzoico e i prodotti derivati dalla polichetide sintasi di tipo III (PKS). Il batterio derivato da sedimenti "Streptomyces maritimus" produce benzoil-CoA in modo simile a quello delle piante a partire dalla fenilalanina, coinvolgendo una reazione mediata da PAL attraverso l'acido cinnamico durante la biosintesi dell'antibiotico polichetide enterocina. Tutti i geni che codificano la biosintesi del benzoil-CoA in "S. maritimus", tranne uno, sono stati clonati, sequenziati e inattivati, fornendo un modello per la biosintesi del benzoato non solo in questo batterio, ma anche in piante in cui l'acido benzoico è un costituente importante di molti prodotti. La recente scoperta che i batteri ospitano PKS omodimerici appartenenti alla superfamiglia CHS vegetale di enzimi condensatori ha ulteriormente collegato le capacità biosintetiche di piante e batteri. Un approccio bioinformatico ha portato a prevedere che l'actinomicete modello Streptomyces coelicolor A3(2) contenga fino a tre PKS di tipo III. L'analisi biochimica di una delle PKS di tipo III ricombinanti di S. coelicolor ha dimostrato l'attività come 1,3,6,8-tetraidrossinaftalene sintasi (THNS). È stato costruito un modello di omologia di THNS basato sulla nota struttura tridimensionale di CHS per esplorare i dettagli strutturali e meccanicistici di questa nuova sottoclasse di PKS batterici.

Beachy, R., Bennetzen, JL, Chassy, BM, Chrispeels, M., Chory, J., Ecker, JR, Noel, JP, Kay, SA, Dean, C., Lamb, C., Jones, J., Santerre, CR, Schroeder, JI, Umen, J., Yanofsky, M., Wessler, S., Zhao, Y., Parrott, W. Prospettive divergenti sugli alimenti geneticamente modificati. (2002) Biotecnologie naturali. 20(12):1195-6; risposta dell'autore 1197. DOI: 10.1038/nbt1202-1195

Zubieta, C., Kota, P., Ferrer, JL, Dixon, RA, Noel, JP Basi strutturali per la modulazione della metilazione del monomero di lignina da parte dell'acido caffeico/acido 5-idrossiferulico 3/5-O-metiltransferasi. (2002) Cellula vegetale. 14 (6): 1265-77.

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Jez, JM, Bowman, ME, Noel, JP Ampliamento del repertorio biosintetico delle polichetidi sintasi di tipo III delle piante mediante modifica della specificità della molecola starter. (2002) Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 99(8):5319-24. DOI: 10.1073/pnas.082590499

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Jez, JM, Bowman, ME, Noel, JP Ruolo dei legami idrogeno nel meccanismo di reazione della calcone isomerasi. (2002) Biochimica. 41 (16): 5168-76.

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Nella biosintesi di flavonoidi, isoflavonoidi e antociani, la calcone isomerasi (CHI) catalizza la ciclizzazione intramolecolare dei calconi in (S)-flavanoni con una costante di velocità del secondo ordine che si avvicina al limite controllato dalla diffusione. Le strutture tridimensionali della CHI di erba medica complessata con diversi flavanoni indicano che due serie di legami a idrogeno possono svolgere ruoli critici nella catalisi. La prima serie di interazioni include due amminoacidi conservati (Thr48 e Tyr106) che mediano una rete di legami a idrogeno con due molecole d'acqua del sito attivo. La seconda serie di legami a idrogeno si verifica tra il gruppo 7-idrossilico del flavanone e due residui del sito attivo (Asn113 e Thr190). Il confronto dei parametri cinetici allo stato stazionario delle CHI wild-type e mutanti dimostra che l'efficiente ciclizzazione di vari calconi nei rispettivi flavanoni richiede entrambe le serie di contatti. Ad esempio, i mutanti T48A, T48S, Y106F, N113A e T190A mostrano riduzioni di 1550, 3, 30, 7 e 6 volte di k(cat) e variazioni di 2-3 volte di K(m) con 4,2',4'-triidrossicalcone come substrato. I confronti cinetici della dipendenza dal pH delle reazioni catalizzate da enzimi wild-type e mutanti indicano che i legami idrogeno nel sito attivo forniti da questi quattro residui non alterano significativamente il pK(a) della reazione di ciclizzazione intramolecolare. Le determinazioni degli effetti dell'isotopo cinetico del solvente e della viscosità del solvente per enzimi wild-type e mutanti rivelano un cambiamento da una reazione controllata dalla diffusione a una limitata dalla chimica nei mutanti T48A e Y106F. Le strutture cristalline a raggi X dei mutanti T48A e Y106F supportano l'affermazione che gli effetti cinetici osservati derivino dalla perdita di legami idrogeno chiave nel sito attivo di CHI. I nostri risultati sono coerenti con un meccanismo di reazione per CHI in cui Thr48 polarizza il chetone del substrato e Tyr106 stabilizza una molecola d'acqua catalitica chiave. I legami idrogeno forniti da Asn113 e Thr190 forniscono ulteriore stabilizzazione nello stato di transizione. La conservazione di questi residui nei CHI di altre specie vegetali implica un meccanismo di reazione comune per la formazione di flavanoni catalizzata da enzimi in tutte le piante.

Richard, SB, Ferrer, JL, Bowman, ME, Lillo, AM, Tetzlaff, CN, Cane, DE, Noel, JP Struttura e meccanismo della 2-C-metil-D-eritritolo 2,4-ciclodifosfato sintasi. Un enzima nel percorso biosintetico degli isoprenoidi indipendente dal mevalonato. (2002) Rivista di chimica biologica. 277(10):8667-72. DOI: 10.1074/jbc.C100739200

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Gang, DR, Lavid, N., Zubieta, C., Chen, F., Beuerle, T., Lewinsohn, E., Noel, JP, Pichersky, E. Caratterizzazione delle fenilpropene O-metiltransferasi del basilico dolce: facile cambiamento della specificità del substrato ed evoluzione convergente all'interno di una famiglia di O-metiltransferasi vegetali. (2002) Cellula vegetale. 14 (2): 505-19.

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Jez, JM, Noel, JP Meccanismo di reazione della calcone isomerasi. Dipendenza dal pH, controllo della diffusione e differenze nel legame del prodotto. (2002) Rivista di chimica biologica. 277(2):1361-9. DOI: 10.1074/jbc.M109224200

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La calcone isomerasi (CHI) catalizza la ciclizzazione intramolecolare dei calconi biciclici in (S)-flavanoni triciclici. L'attività della CHI è essenziale per la biosintesi dei precursori flavanonici dei pigmenti floreali e dei composti fenilpropanoidi di difesa delle piante. Abbiamo esaminato le reazioni di ciclizzazione spontanee e catalizzate dalla CHI di 4,2',4',6'-tetraidrossicalcone, 4,2',4'-triidrossicalcone, 2',4'-diidrossicalcone e 4,2'-diidrossicalcone nei corrispondenti flavanoni. La dipendenza dal pH della formazione dei flavanoni indica che sia le reazioni non enzimatiche che quelle enzimatiche richiedono innanzitutto la ionizzazione in fase di massa del gruppo 2'-idrossilico del substrato e successivamente la reattività del 2'-ossianione neoformato durante la formazione dell'anello C. Esperimenti sulla viscosità del solvente dimostrano che a pH 7.5 le reazioni di ciclizzazione catalizzate da CHI di 4,2',4',6'-tetraidrossicalcone, 4,2',4'-triidrossicalcone e 2',4'-diidrossicalcone sono controllate dalla diffusione per circa il 90%, mentre la ciclizzazione del 4,2'-diidrossicalcone è limitata da un passaggio chimico che probabilmente riflette il pK(a) più elevato del gruppo 2'-idrossile. A pH 6.0, le reazioni con 4,2',4',6'-tetraidrossicalcone e 4,2',4'-triidrossicalcone sono limitate dalla diffusione per circa il 50%, mentre le reazioni di entrambi i diidrossicalconi sono limitate da passaggi chimici. Il confronto delle strutture cristalline con risoluzione 2.1-2.3 A del CHI complessato con i prodotti 7,4'-diidrossiflavanone, 7-idrossiflavanone e 4'-idrossiflavanone mostra che i 7-idrossiflavanoni condividono tutti una modalità di legame comune, mentre il 4'-idrossiflavanone si lega con un orientamento alterato al sito attivo. I nostri studi funzionali e strutturali supportano l'ipotesi che il CHI acceleri la ciclizzazione intramolecolare stereochimicamente definita dei calconi in (2S)-flavanoni biologicamente attivi, legando selettivamente un calcone ionizzato in una conformazione che favorisce la chiusura dell'anello in una reazione controllata dalla diffusione.

Lu, PJ, Zhou, XZ, Liou, YC, Noel, JP, Lu, KP Ruolo critico della fosforilazione del dominio WW nella regolazione dell'attività di legame della fosfoserina e della funzione Pin1. (2002) Rivista di chimica biologica. 277(4):2381-4. DOI: 10.1074/jbc.C100228200

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Jez, JM, Ferrer, JL, Bowman, ME, Austin, MB, Schröder, J., Dixon, RA, Noel, JP Struttura e meccanismo delle polichetidi sintasi simili alla calcone sintasi. (2001) Rivista di microbiologia industriale e biotecnologia. 27(6):393-8. DOI: 10.1038/sj/jim/7000188

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Jez, JM, Bowman, ME, Noel, JP Programmazione guidata dalla struttura della determinazione della lunghezza della catena del polichetide nella calcone sintasi. (2001) Biochimica. 40 (49): 14829-38.

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La calcone sintasi (CHS) appartiene alla famiglia delle polichetide sintasi di tipo III (PKS) che catalizzano la formazione di polichetidi strutturalmente diversi. La CHS sintetizza un tetrachetide mediante condensazione sequenziale di tre anioni acetilici derivati dalla decarbossilazione del malonil-CoA a un gruppo p-cumarolico legato a una cisteina del sito attivo. Gly256 si trova sulla superficie del sito attivo della CHS, a diretto contatto con la catena polichetidica derivata dal malonil-CoA. Pertanto, la posizione 256 funge da bersaglio ideale per indagare il legame tra il volume della cavità e la determinazione della lunghezza della catena polichetidica nella PKS di tipo III. L'esame funzionale dei mutanti CHS G256A, G256V, G256L e G256F rivela profili di prodotto alterati rispetto a quelli della CHS di tipo selvatico. Utilizzando p-cumaril-CoA come molecola starter, i mutanti G256A e G256V producono una quantità notevolmente maggiore di tetrachetide lattone. Ulteriori restrizioni nel volume della cavità, come quelle osservate nei mutanti G256L e G256F, determinano livelli crescenti di stirilpirone bis-norangonina da un intermedio trichetidico. Le strutture cristallografiche a raggi X dei mutanti CHS G256A, G256V, G256L e G256F stabiliscono che queste sostituzioni riducono le dimensioni della cavità del sito attivo senza alterazioni significative nelle conformazioni degli scheletri polipeptidici. Il volume della catena laterale in posizione 256 influenza sia il numero di reazioni di condensazione durante l'estensione della catena polichetidica sia la conformazione degli intermedi trichetidici e tetrachetidici durante la reazione di ciclizzazione. Questi risultati, considerati insieme alla variazione naturale della sequenza del residuo 256, suggeriscono che una rapida diversificazione della specificità del prodotto senza la concomitante perdita di sostanziale attività catalitica negli enzimi simili a CHS correlati può verificarsi mediante l'evoluzione sito-specifica del volume della catena laterale nella posizione 256.

Richard, SB, Bowman, ME, Kwiatkowski, W., Kang, I., Chow, C., Lillo, AM, Cane, DE, Noel, JP Struttura della 4-difosfocitidil-2-C-metileritritolo sintetasi coinvolta nella biosintesi degli isoprenoidi indipendenti dal mevalonato. (2001) Biologia strutturale della natura. 8(7):641-8. DOI: 10.1038/89691

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Zubieta, C., Lui, XZ, Dixon, RA, Noel, JP Le strutture di due metiltransferasi di prodotti naturali rivelano la base della specificità del substrato nelle O-metiltransferasi vegetali. (2001) Biologia strutturale della natura. 8(3):271-9. DOI: 10.1038/85029

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Jez, JM, Austin, MB, Ferrer, J., Bowman, ME, Schröder, J., Noel, JP Controllo strutturale della formazione di polichetidi nelle sintasi di polichetidi specifiche delle piante. (2000) Chimica e biologia. 7 (12): 919-30.

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Jez, JM, Noel, JP Meccanismo della calcone sintasi. pKa della cisteina catalitica e ruolo dell'istidina conservata in una polichetide sintasi vegetale. (2000) Rivista di chimica biologica. 275(50):39640-6. DOI: 10.1074/jbc.M008569200

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Jez, JM, Bowman, ME, Dixon, RA, Noel, JP Struttura e meccanismo dell'enzima vegetale calcone isomerasi, unico nel suo genere ed evoluzionistico. (2000) Biologia strutturale della natura. 7(9):786-91. DOI: 10.1038/79025

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Verdecia, MA, Bowman, ME, Lu, KP, Hunter, T., Noel, JP Basi strutturali per il riconoscimento della fosfoserina-prolina da parte dei domini WW del gruppo IV. (2000) Biologia strutturale della natura. 7(8):639-43. DOI: 10.1038/77929

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Verdecia, MA, Huang, H., Dutil, E., Kaiser, DA, Hunter, T., Noel, JP La struttura della proteina anti-apoptotica umana survivina rivela una disposizione dimerica. (2000) Biologia strutturale della natura. 7(7):602-8. DOI: 10.1038/76838

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Jez, JM, Ferrer, JL, Bowman, ME, Dixon, RA, Noel, JP Dissezione della decarbossilazione del malonil-coenzima A dalla formazione di polichetide nel meccanismo di reazione di una polichetide sintasi vegetale. (2000) Biochimica. 39 (5): 890-902.

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La calcone sintasi (CHS) catalizza la formazione del calcone fenilpropanoide a partire da un p-cumaril-CoA e tre tioesteri del malonil-coenzima A (CoA). La struttura tridimensionale della CHS [Ferrer, J.-L., Jez, JM, Bowman, ME, Dixon, RA e Noel, JP (1999) Nat. Struct. Biol. 6, 775-784] suggerisce che quattro residui (Cys164, Phe215, His303 e Asn336) partecipino alle molteplici reazioni di decarbossilazione e condensazione catalizzate da questo enzima. In questo lavoro, caratterizziamo funzionalmente 16 mutanti puntiformi di questi residui per la produzione di calcone, la decarbossilazione del malonil-CoA e la capacità di legare CoA e acetil-CoA. I nostri risultati confermano il ruolo di Cys164 come nucleofilo del sito attivo nella formazione del polichetide e chiariscono l'importanza di His303 e Asn336 nella reazione di decarbossilazione del malonil-CoA. Suggeriamo che Phe215 possa contribuire a orientare i substrati nel sito attivo durante l'allungamento dell'intermedio polichetidico. Per comprendere meglio le relazioni struttura-funzione in alcuni di questi mutanti, abbiamo anche determinato le strutture cristalline dei mutanti CHS C164A, H303Q e N336A, raffinati rispettivamente a una risoluzione di 1.69, 2.0 e 2.15 Å. La struttura del mutante C164A rivela che la lacuna ossianionica proposta formata da His303 e Asn336 rimane inalterata, consentendo a questo mutante di catalizzare la decarbossilazione del malonil-CoA senza formazione di calcone. Le strutture dei mutanti H303Q e N336A supportano l'importanza di His303 e Asn336 nella polarizzazione del tioestere carbonilico del malonil-CoA durante la reazione di decarbossilazione. Inoltre, entrambi questi residui possono anche contribuire alla stabilizzazione dello stato di transizione tetraedrico durante l'allungamento del polichetide. La conservazione delle funzioni catalitiche dei residui del sito attivo può verificarsi in un'ampia varietà di enzimi condensatori, tra cui altre sintasi di polichetidi e acidi grassi.

Jiang, G., den Hertog, J., Su, J., Noel, J., Sap, J., Hunter, T. La dimerizzazione inibisce l'attività della proteina recettoriale tirosina fosfatasi-alfa. (1999) Natura. 401(6753):606-10. DOI: 10.1038/44170

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Ferrer, JL, Jez, JM, Bowman, ME, Dixon, RA, Noel, JP Struttura della calcone sintasi e basi molecolari della biosintesi dei polichetidi nelle piante. (1999) Biologia strutturale della natura. 6(8):775-84. DOI: 10.1038/11553

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Majeti, R., Bilwes, AM, Noel, JP, Hunter, T., Weiss, A. Inibizione indotta dalla dimerizzazione della funzione della proteina recettore tirosina fosfatasi attraverso un cuneo inibitorio. (1998) Scienza. 279 (5347): 88-91.

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Starks, CM, Back, K., Chappell, J., Noel, JP Basi strutturali per la biosintesi ciclica dei terpeni da parte della 5-epi-aristolochene sintasi del tabacco. (1997) Scienza. 277 (5333): 1815-20.

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Noel, JP Disattivare l'interruttore Ras con un semplice tocco di un dito. (1997) Biologia strutturale della natura. 4 (9): 677-80.

Ranganathan, R., Lu, KP, Hunter, T., Noel, JP L'analisi strutturale e funzionale della rotamasi mitotica Pin1 suggerisce che il riconoscimento del substrato dipende dalla fosforilazione. (1997) Cellula. 89 (6): 875-86.

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Bilwes, AM, den Hertog, J., Hunter, T., Noel, JP Basi strutturali per l'inibizione del recettore proteico-tirosina fosfatasi-alfa mediante dimerizzazione. (1996) Natura. 382(6591):555-9. DOI: 10.1038/382555a0

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Sondek, J., Lambright, DG, Noel, JP, Hamm, HE, Sigler, PB Meccanismo GTPasico delle proteine G dalla struttura cristallina 1.7-A della transducina alfa-GDP-AIF-4. (1994) Natura. 372(6503):276-9. DOI: 10.1038/372276a0

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Lambright, DG, Noel, JP, Hamm, HE, Sigler, PB Determinanti strutturali per l'attivazione della subunità alfa di una proteina G eterotrimerica. (1994) Natura. 369(6482):621-8. DOI: 10.1038/369621a0

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Noel, JP, Hamm, HE, Sigler, PB Struttura cristallina 2.2 A della transducina-alfa complessata con GTP gamma S. (1993) Natura. 366(6456):654-63. DOI: 10.1038/366654a0

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Dupureur, CM, Yu, BZ, Jain, MK, Noel, JP, Deng, T., Li, Y., Byeon, IJ, Tsai, MD Ingegneria della fosfolipasi A2. Ruoli strutturali e funzionali dei residui altamente conservati del sito attivo tirosina-52 e tirosina-73. (1992) Biochimica. 31 (28): 6402-13.

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La mutagenesi sito-specifica è stata utilizzata per indagare i ruoli strutturali e funzionali di due residui altamente conservati, Tyr-52 e Tyr-73, nella catalisi interfacciale della fosfolipasi pancreatica bovina A2 (PLA2, sovraprodotta in Escherichia coli). Secondo le strutture cristalline, le catene laterali di questi due residui del sito attivo formano legami a idrogeno con il carbossilato del residuo catalitico Asp-99. La sostituzione di uno o entrambi i residui di Tyr con Phe ha determinato solo lievi variazioni nelle velocità catalitiche, il che suggerisce che i legami a idrogeno non sono essenziali per la catalisi da parte della PLA2. La sostituzione di uno dei residui di Tyr con amminoacidi non aromatici ha portato a sostanziali diminuzioni nel kcat apparente verso le micelle di 1,2-diottanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DC8PC) e nel v(o) (numero di turnover alla massima concentrazione del substrato, ovvero frazione molare = 1) verso le vescicole di 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfometanolo (DC14PM) nella cinetica della modalità scooting [Berg, OG, Yu, B.-Z., Rogers, J. e Jain, MK (1991) Biochemistry 30, 7283-7297]. Il mutante Y52V è stato ulteriormente analizzato in dettaglio mediante la cinetica della modalità scooting: l'equilibrio E-E* è stato esaminato mediante fluorescenza; Le costanti di dissociazione di E*S, E*P ed E*I (rispettivamente KS*, KP* e KI*) in presenza di Ca2+ sono state misurate mediante protezione della modificazione dell'istidina-48 e mediante spettroscopia UV differenziale; la costante di Michaelis KM* è stata calcolata dalle velocità iniziali di idrolisi in assenza e presenza di inibitori competitivi; e il numero di turnover in condizioni di saturazione (kcat, che è un valore teorico poiché l'enzima potrebbe non essere saturo all'interfaccia) è stato calcolato dai valori di vo e KM*. I risultati hanno indicato una piccola perturbazione nella fase di legame interfacciale (da E a E*), ma aumenti di circa 10 volte di KS*, KP*, KI* e KM* e una diminuzione inferiore a 10 volte di kcat. Tali cambiamenti nella funzione di Y52V non sono dovuti a cambiamenti conformazionali globali poiché le proprietà NMR protoniche di Y52V assomigliano molto a quelle della PLA2 di tipo selvatico; È probabile che sia causato da interazioni enzima-substrato alterate nel sito attivo. Tyr-73 sembra svolgere un importante ruolo strutturale. La stabilità conformazionale di tutti i mutanti Tyr-73 è diminuita di 4-5 kcal/mol rispetto a quella della PLA2 di tipo selvatico. Le proprietà NMR protoniche di Y73A hanno suggerito significativi cambiamenti conformazionali e un aumento sostanziale della flessibilità conformazionale. Queste dettagliate analisi strutturali e funzionali rappresentano un importante progresso nello studio struttura-funzione di un enzima coinvolto nella catalisi interfacciale.

Noel, JP, Bingman, CA, Deng, TL, Dupureur, CM, Hamilton, KJ, Jiang, RT, Kwak, JG, Sekharudu, C., Sundaralingam, M., Tsai, MD Ingegneria della fosfolipasi A2. Evidenze strutturali e funzionali a raggi X dell'interazione della lisina-56 con i substrati. (1991) Biochimica. 30 (51): 11801-11.

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Studi di mutagenesi sito-specifica della fosfolipasi pancreatica bovina A2 (PLA2, sovraprodotta in Escherichia coli) hanno mostrato che la sostituzione del residuo di superficie Lys-56 con un residuo amminoacidico neutro o idrofobico ha determinato un cambiamento inaspettato e significativo nella funzione dell'enzima. Il kcat per le micelle di fosfatidilcolina aumenta di 3-4 volte per K56M, K56I e K56F e di circa 2 volte per K56N e K56T, ma non cambia per K56R. Questi risultati suggeriscono che la catena laterale del residuo 56 ha un'influenza significativa sull'attività della PLA2. Per sondare la base strutturale dell'attività potenziata, le strutture cristalline della PLA56 di tipo selvatico e K2M sono state determinate mediante cristallografia a raggi X con una risoluzione di 1.8 A. I risultati suggeriscono che la mutazione non solo ha perturbato localmente la conformazione della catena laterale di Met-56, ma ha anche causato cambiamenti conformazionali nell'ansa vicina (residui 60-70), con conseguente formazione di una tasca idrofobica da parte dei residui Met-56, Tyr-52 e Tyr-69. L'ancoraggio di un analogo inibitore della fosfatidilcolina nel sito attivo di K56M, secondo la struttura del complesso PLA2-analogo inibitore della fosfatidiletanolammina del veleno di cobra [White, SP, Scott, DL, Otwinowski, Z., Gleb, MH e Sigler, P. (1990) Science 250, 1560-1563], ha mostrato che la porzione colinica [N(CH3)3]+ si adatta facilmente alla tasca idrofobica di nuova formazione con un elevato grado di complementarietà di superficie. Ciò suggerisce una possibile interazione tra il residuo 56 e il gruppo di testa del fosfolipide, spiegando le attività potenziate osservate quando la Lys-56 carica positivamente viene sostituita da residui apolari, ovvero K56M, K56I e K56F. Un ulteriore supporto a questa interpretazione deriva dal potenziamento di 5 volte in kcat per il mutante K56E con una catena laterale caricata negativamente, dove si verificherebbe un'interazione elettrostatica attrattiva tra la catena laterale di Glu-56 e la porzione di colina caricata positivamente. I nostri risultati confutano anche un recente studio [Tomasselli, AG, Hui, J., Fisher, J., Zürcher-Neely, H., Reardon, IM, Oriaku, E., Kézdy, FJ, & Heinrikson, RL (1989) J. Biol. Chem. 264, 10041-10047] secondo cui l'acilazione a livello di substrato di Lys-56 è un passaggio obbligatorio nella catalisi da parte di PLA2.

Deng, TL, Noel, JP, Tsai, MD Un nuovo vettore di espressione per la sintesi e la secrezione ad alto livello di proteine estranee in Escherichia coli: sovrapproduzione di fosfolipasi pancreatica bovina A2. (1990) Gene. 93 (2): 229-34.

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Noel, JP, Tsai, MD Ingegneria della fosfolipasi A2: progettazione, sintesi ed espressione di un gene per la (pro)fosfolipasi A2 bovina. (1989) J. Cell. Biochimica 40(3):309-20. DOI: 10.1002/jcb.240400307

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Lin, G., Noel, J., Loffredo, W., Stabile, HZ, Tsai, MD Utilizzo di ciclopentano-fosfatidilcoline a catena corta per indagare la modalità di attivazione della fosfolipasi A2 nel pancreas bovino e nel veleno d'api. (1988) Rivista di chimica biologica. 263 (26): 13208-14.

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Un grande mistero nel meccanismo della fosfolipasi A2 (PLA2) e di molti altri enzimi lipolitici è l'"attivazione interfacciale" indotta da substrati micellari ma non monomerici. Altrettanto misteriosa è la mancanza di attivazione interfacciale nella PLA2 del veleno d'ape, a differenza delle PLA2 del pancreas e di altre fonti. Abbiamo indagato questi problemi utilizzando gli analoghi ciclopentano a catena corta conformazionalmente ristretti della diacilfosfatidilcolina (Cp-DCnPC, isomero tutto-trans). Nella reazione catalizzata dalla PLA2 pancreatica bovina, la Cp-DC8PC si è comportata in modo diverso dalla DC8PC in quanto i suoi monomeri e micelle hanno mostrato attività comparabili (ma inferiori a quella della DC8PC). Questo risultato suggerisce che l'attività della PLA2 può essere regolata dalla conformazione del substrato e supporta il "modello di conformazione del substrato" (Wells, MA (1974) Biochemistry 13, 2248-2257), ma solleva la questione se la Cp-DC8PC imiti i monomeri o le micelle della DC8PC. L'analisi conformazionale mediante 1H NMR ha rivelato che la Cp-DC8PC monomerica era conformazionalmente ristretta in prossimità della regione carbonilica, una proprietà caratteristica delle micelle. Pertanto, la CP-DC8PC monomerica può essere considerata un analogo conformazionale delle micelle, ma l'importante caratteristica strutturale risiede nella regione CH2COO anziché nello scheletro del glicerolo. La CP-DC8PC è stata quindi utilizzata per testare una precedente ipotesi secondo cui la PLA2 del veleno d'api idrolizza i monomeri ma non le micelle (il che predirebbe poca o nessuna attività per la Cp-DC8PC poiché la sua conformazione è simile a quella delle micelle sia al di sotto che al di sopra della sua concentrazione micellare critica). I risultati hanno mostrato che Cp-DC8PC è un substrato relativamente buono per la PLA2 del veleno d'ape rispetto alla PLA2 pancreatica. Questa e altre prove suggeriscono che la PLA2 del veleno d'ape non è sensibile alla conformazione dei substrati monomerici e micellari e idrolizza sia i monomeri che le micelle. I risultati in entrambe le PLA2 dimostrano l'utilità dei ciclopentano-fosfolipidi nello studio del meccanismo delle fosfolipasi e del ruolo della conformazione del substrato nella catalisi della PLA2.

Dott. Joseph Noel

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