Una sostanza chimica "innaturale" consente ai ricercatori del Salk di osservare l'azione delle proteine nelle cellule cerebrali

Luglio 5, 2011

Una sostanza chimica “innaturale” consente ai ricercatori del Salk di osservare l’azione delle proteine nelle cellule cerebrali

Strumenti geneticamente incorporati nelle cellule staminali neurali potrebbero contribuire allo sviluppo della medicina rigenerativa, fondamentale per terapie basate sulle cellule staminali sicure e affidabili.

Luglio 5, 2011

LA JOLLA, CA—I ricercatori del Salk Institute sono riusciti a incorporare geneticamente amminoacidi “innaturali”, come quelli che emettono fluorescenza verde, nelle cellule staminali neurali, che poi si differenziano in neuroni cerebrali con il “tag” incandescente intatto.

Dicono che questa nuova tecnica, descritta nel numero online del 16 giugno di Cellule staminali, potrebbe aiutare gli scienziati a indagare i misteri di molti diversi tipi di cellule staminali negli esseri umani, nonché delle cellule da esse prodotte. Questo potrebbe rappresentare un vantaggio sia per la ricerca di base che per quella clinica, contribuendo ad accelerare lo sviluppo della medicina rigenerativa basata sulle cellule staminali.

"Le cellule staminali hanno un grande potenziale per il trattamento di varie malattie, ma è stato difficile studiare come si auto-rinnovano e producono tutte le cellule del corpo", afferma l'autore principale dello studio, Lei Wang, professore associato e titolare della cattedra di sviluppo Frederick B. Rentschler presso il Laboratorio di biologia chimica e proteomica.

"La capacità di incorporare geneticamente amminoacidi non naturali nelle proteine delle cellule staminali accelererà la nostra comprensione delle reti di segnalazione che controllano queste cellule staminali", afferma. Una conoscenza approfondita di questi meccanismi è fondamentale per terapie con cellule staminali sicure e affidabili.

Il primo autore dello studio, il dott. Bin Shen, aggiunge che l'incorporazione di amminoacidi non naturali "consente ai ricercatori di studiare una particolare proteina in una cellula o in un organismo vivente, rispetto ai tradizionali metodi biochimici condotti attraverso in vitro impostazioni come una provetta." Questi studi possono essere condotti anche in tempo reale, afferma Shen, ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Wang.

L'uso di amminoacidi non naturali (Uaas) è stato sviluppato da Wang e dai suoi colleghi ed è stato utilizzato per la prima volta nei batteri nel 2001 e nelle cellule dei mammiferi nel 2007. Questo è il primo rapporto sul suo utilizzo nelle cellule staminali.

A questo studio, condotto in due fasi, hanno collaborato chimici, biologi molecolari e cellulari del Salk ed esperti di struttura proteica.

La prima fase consisteva nel verificare se gli Uaas potessero essere incorporati nelle cellule staminali neurali senza interromperne il processo di differenziazione e, in tal caso, se il tag fluorescente inserito sarebbe stato trasportato nelle cellule neuronali create dalle cellule staminali.

"Gli attuali metodi per l'incorporazione di Uaa non sono appropriati per le cellule staminali, perché i geni aggiunti vengono spesso persi prima che la cellula staminale abbia la possibilità di completare il processo di differenziazione", afferma Wang. Per risolvere questo problema, i ricercatori hanno sviluppato un metodo di somministrazione genica basato su lentivirali per incorporare gli Uaa nelle proteine espresse nelle cellule staminali neurali. "La tecnica di terapia genica lentivirale, sviluppata dal Dr. Inder Verma al Salk, può garantire un'espressione a lungo termine attraverso la differenziazione delle cellule staminali", afferma Wang.

Il virus è stato utilizzato per fornire diversi componenti necessari alla tecnologia Uaas. Questi consistevano in un RNA transfer sintetico (tRNA) che le cellule utilizzano per incorporare gli amminoacidi in una proteina in fase di produzione all'interno della cellula. La seconda molecola è una sintetasi enzimatica in grado di riconoscere il tRNA ingegnerizzato e caricarlo con la terza molecola ingegnerizzata, un amminoacido artificiale. Questi amminoacidi sono chimicamente diversi dai 20 amminoacidi naturalmente presenti nell'organismo; possono essere ingegnerizzati per ottenere diverse proprietà desiderabili, come la fluorescenza.

"Una volta ottenuta una linea di cellule staminali che incorpora stabilmente gli Uaas, è possibile personalizzarli per studiarne la biologia", afferma Wang. "Si ottiene anche il vantaggio di ottenere diverse cellule mature con questa capacità attraverso la differenziazione, come i neuroni, in cui è difficile inserire gli Uaas e dove sono costosi da reperire in grandi quantità".

Nella prima serie di esperimenti, i ricercatori hanno scoperto che gli Uaas venivano incorporati con successo nelle cellule staminali neurali, che l'incorporazione durava per tutta la differenziazione e che queste cellule producevano neuroni portatori dell'amminoacido fluorescente.

La seconda serie di esperimenti mirava a dimostrare come questi Uaas potessero essere utilizzati per risolvere un problema biologico. I ricercatori volevano capire come funzionassero nei neuroni i canali ionici sensibili al voltaggio, proteine che formano pori. In queste cellule nervose, i canali ionici di membrana rispondono alle variazioni della corrente elettrica – il segnale elettrico trasmesso tra i neuroni – che li attiva o li silenzia.

"Stiamo cercando di capire come il campo elettrico delle membrane cellulari possa accendere o spegnere le attività delle proteine, proprio come un interruttore in una casa accende o spegne le luci", afferma Wang.

Per studiare questo fenomeno, i ricercatori hanno incorporato un Uaa fluorescente in un dominio proteico che il canale ionico e altre proteine utilizzavano per rilevare il campo elettrico nelle cellule staminali neurali, che producevano neuroni con lo stesso Uaa incorporato. Hanno quindi potuto osservare, in tempo reale, il tag fluorescente in base alle variazioni di corrente elettrica attraverso il neurone. "Abbiamo rilevato variazioni nell'intensità di fluorescenza dell'Uaa quando i neuroni venivano stimolati, e queste variazioni dipendono dal punto in cui l'Uaa è stata incorporata, il che suggerisce che diverse posizioni della proteina si stanno spostando all'interno o all'esterno della membrana in risposta al campo elettrico."

Wang afferma che questo esperimento, progettato per dimostrare il potere dell'Uaas nelle cellule cerebrali, può essere adattato anche per studiare altre proteine di membrana in altre cellule, indipendentemente dalla loro posizione nel corpo.

Tra i coautori figurano i ricercatori del Salk Dr. Zheng Xiang, Dr. Barbara Miller, Dr. Gordon Louie, Dr. Wenyuan Wang, Dr. Joseph P. Noel e Dr. Fred Gage.

Lo studio è stato finanziato dal California Institute for Regenerative Medicine, dalla March of Dimes Foundation e dai National Institutes of Health.

Informazioni sul CIRM:
Il California Institute for Regenerative Medicine sta accelerando lo sviluppo di nuove terapie per malattie croniche e lesioni finanziando programmi di ricerca sulle cellule staminali in tutta la California. Siamo stati fondati nel 2004 dopo l'approvazione da parte dei californiani della Proposta 71, la California Stem Cell Research and Cures Initiative. La proposta di legge statale, che ha stanziato 3 miliardi di dollari per la ricerca sulle cellule staminali presso università e istituti di ricerca californiani, prevedeva l'istituzione di una nuova agenzia statale per erogare sovvenzioni e prestiti per la ricerca sulle cellule staminali, strutture di ricerca e altre importanti opportunità di ricerca. La missione del CIRM è supportare e promuovere la ricerca sulle cellule staminali e la medicina rigenerativa secondo i più elevati standard etici e medici per la scoperta e lo sviluppo di cure, terapie, diagnosi e tecnologie di ricerca per alleviare le sofferenze umane causate da malattie croniche e lesioni.

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Il Salk Institute for Biological Studies è uno dei più importanti istituti di ricerca di base al mondo, dove docenti di fama internazionale affrontano questioni fondamentali delle scienze della vita in un ambiente unico, collaborativo e creativo. Concentrati sia sulla scoperta che sulla formazione delle future generazioni di ricercatori, gli scienziati del Salk forniscono contributi innovativi alla nostra comprensione di cancro, invecchiamento, Alzheimer, diabete e malattie infettive, studiando neuroscienze, genetica, biologia cellulare e vegetale e discipline correlate.

I risultati conseguiti dal corpo docente sono stati riconosciuti con numerosi riconoscimenti, tra cui premi Nobel e l'iscrizione alla National Academy of Sciences. Fondato nel 1960 dal pioniere del vaccino contro la poliomielite Jonas Salk, l'Istituto è un'organizzazione indipendente senza scopo di lucro e un punto di riferimento architettonico.