Publicaciones - Instituto Salk de Estudios Biológicos

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2024

Newman, LE, Weiser Novak, S., Rojas, GR, Tadepalle, N., Schiavon, CR, Grotjahn, DA, Towers, CG, Tremblay, M., Donnelly, MP, Ghosh, S., Medina, M., Rocha, S., Rodríguez-Enríquez, R., Chevez, JA, Lemersal, I., Manor, U., Sombra, GS El estrés en la replicación del ADN mitocondrial desencadena una vía endosómica proinflamatoria de eliminación de nucleoides. (2024) Biología celular de la naturaleza. DOI: 10.1038/s41556-023-01343-1

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El ADN mitocondrial (ADNmt) codifica subunidades esenciales del sistema de fosforilación oxidativa, pero también es un patrón molecular asociado al daño importante (DAMP) que activa sensores inmunes innatos cuando se libera en el citoplasma, fuera de las células o en la circulación. Como DAMP, el ADNmt no solo contribuye a la resistencia a los antivirales, sino que también causa inflamación patógena en muchos contextos de enfermedades. Las células que experimentan estrés en el ADNmt causado por el agotamiento de la proteína que empaqueta el ADNmt, el factor de transcripción A, mitocondrial (TFAM) o durante la infección por el virus del herpes simple-1 exhiben mitocondrias alargadas, agrandamiento de los nucleoides (complejos de proteína-ADNmt) y activación de cGAS-STING innato. señalización inmune a través del ADNmt liberado en el citoplasma. Sin embargo, la relación entre las mitocondrias aberrantes y la dinámica de los nucleoides, la liberación de ADNmt y la activación de cGAS-STING aún no está clara. Aquí mostramos que, bajo una variedad de condiciones de estrés para la replicación del ADNmt y durante la infección por el virus del herpes simple-1, los nucleoides agrandados que permanecen unidos a TFAM salen de las mitocondrias. Los nucleoides agrandados surgen de que el ADNmt experimenta estrés de replicación, lo que provoca la agrupación de nucleoides a través de un bloqueo en la fisión mitocondrial en una etapa en la que normalmente comenzaría la polimerización de actina del retículo endoplasmático, definiendo un punto de control de fisión que garantiza que el ADNmt haya completado la replicación y sea competente para la segregación en mitocondrias hijas. La participación crónica de este punto de control da como resultado un mayor tráfico de nucleoides hacia los endosomas tempranos y luego tardíos para su eliminación. La rotura endosómica durante el tránsito a través de esta vía endosómica provoca en última instancia la activación de cGAS-STING mediada por ADNmt. Por lo tanto, proponemos que los nucleoides incompetentes para la replicación se eliminen selectivamente mediante una vía adaptativa de control de calidad mitocondrial-endosomal que es propensa a la activación del sistema inmunológico innato, lo que podría representar un objetivo terapéutico para prevenir la inflamación mediada por el ADNmt durante la infección viral y otros estados patógenos.

2023

Victorelli, S., Salmonowicz, H., Chapman, J., Martini, H., Vizioli, MG, Riley, JS, Cloix, C., Hall-Younger, E., Machado Espindola-Netto, J., Jurk, D., Lagnado, AB, Sales Gomez, L., Farr, JN, Saul, D., Reed, R., Kelly, G., Eppard, M., Greaves, LC, Dou, Z., Pirius, N. , Szczepanowska, K., Porritt, RA, Huang, H., Huang, TY, Mann, DA, Masuda, CA, Khosla, S., Dai, H., Kaufmann, SH, Zacharioudakis, E., Gavathiotis, E. , LeBrasseur, NK, Lei, X., Sainz, AG, Korolchuk, VI, Adams, PD, Sombra, GS, Tait, SWG, Passos, JF El estrés apoptótico provoca la liberación de ADNmt durante la senescencia e impulsa el SASP. (2023) Naturaleza. DOI: 10.1038/s41586-023-06621-4

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Mangalhara, KC, Varanasi, SK, Johnson, MA, Burns, MJ, Rojas, GR, Esparza Moltó, PB, Sainz, AG, Tadepalle, N., Abbott, KL, Mendiratta, G., Chen, D., Farsakoglu, Y., Kunchok, T., Hoffmann, FA, Parisi, B., Rincón, M., Vander Heiden, MG, Bosenberg, M., Hargreaves, DC, Kaech, SM, Sombra, GS La manipulación del flujo de electrones mitocondriales mejora la inmunogenicidad del tumor. (2023) Ciencia. 381(6664):1316-1323. DOI: 10.1126/ciencia.abq1053

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Lei, Y., VanPortfliet, JJ, Chen, YF, Bryant, JD, Li, Y., Fails, D., Torres-Odio, S., Ragan, KB, Deng, J., Mohan, A., Wang, B., Brahms, ON, Yates, SD, Spencer, M., Tong, CW, Bosenberg, MW, West, LC, Sombra, GS, Shutt, TE, Upton, JW, Li, P., Oeste, AP La detección cooperativa del ADN mitocondrial por ZBP1 y cGAS promueve la cardiotoxicidad. (2023) Cell. DOI: 10.1016/j.cell.2023.05.039

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Al Khatib, I., Deng, J., Lei, Y., Torres-Odio, S., Rojas, GR, Newman, LE, Chung, BK, Symes, A., Zhang, H., Huang, SN, Pommier , Y., Kan, A., Sombra, GS, Oeste, AP, Gibson, WT, Shutt, TE Activación de la respuesta inmune innata cGAS-STING en células con topoisomerasa mitocondrial deficiente TOP1MT. (2023) Genética Molecular Humana. DOI: 10.1093/hmg/ddad062

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El reconocimiento de que el mtDNA citosólico activa la señalización inmunitaria innata de cGAS-STING ha desbloqueado nuevos mecanismos de enfermedad. Aquí, se descubrió una variante no caracterizada que se predijo que afectaría la función TOP1MT, P193L, en una familia con múltiples enfermedades autoinmunes de aparición temprana, incluido el lupus eritematoso sistémico (SLE). Aunque no había una asociación genética previa entre TOP1MT y la enfermedad autoinmune, el papel de TOP1MT como regulador del mtDNA nos llevó a investigar si TOP1MT podría mediar en la liberación de mtDNA al citosol, donde luego podría activar la vía inmune innata cGAS-STING. se sabe que se activa en el LES y otras enfermedades autoinmunes. A través del análisis de células con expresión reducida de TOP1MT, mostramos que la pérdida de TOP1MT da como resultado la liberación de mtDNA al citosol, lo que activa la vía cGAS-STING. También caracterizamos la variante P193L por su capacidad para rescatar varias funciones TOP1MT cuando se expresa en células knockout TOP1MT. Mostramos que la variante P193L no es completamente funcional, ya que su reexpresión a niveles altos no pudo rescatar los déficits de respiración mitocondrial y solo mostró un rescate parcial para otras funciones, incluida la reposición de la replicación del ADNmt después del agotamiento, el tamaño del nucleoide, el ADNmt en estado estacionario niveles de transcripciones y morfología mitocondrial. Además, la expresión de P193L a niveles endógenos no pudo rescatar la señalización de cGAS-STING mediada por la liberación de mtDNA. En general, informamos un vínculo entre TOP1MT y la liberación de mtDNA que conduce a la activación de cGAS-STING. Además, mostramos que la variante P193L tiene una pérdida parcial de función que puede contribuir a la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes a través de la activación del sistema inmunitario innato mediada por cGAS-STING.

Malik, N., Ferreira, BI, Hollstein, PE, Curtis, SD, Trefts, E., Weiser Novak, S., Yu, J., Gilson, R., Hellberg, K., Fang, L., Sheridan, A., Ja, N., Sombra, GS, Manor, U., Shaw, RJ Inducción de biogénesis lisosomal y mitocondrial por fosforilación AMPK de FNIP1. (2023) Ciencia. 380(6642):eabj5559. DOI: 10.1126/ciencia.abj5559

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Newman, LE, Sombra, GS Liberación de ADN mitocondrial en la señalización inmune innata. (2023) Revisión anual de bioquímica. DOI: 10.1146/annurev-biochem-032620-104401

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Nassour, J., Aguiar, LG, Correia, A., Schmidt, T., Mainz, L., Przetocka, S., Haggblom, C., Tadepalle, N., Williams, A., Shokhirev, MN, Akincilar, SC, Tergaonkar, V., Shadel, S., Karlseder, J. La señalización de telómero a mitocondria por ZBP1 media la crisis replicativa (2023) Naturaleza. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05710-8

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2022

Cobo, I., Tanaka, TN, Chandra Mangalhara, K., Lana, A., Yeang, C., Han, C., Schlachetzki, J., Challcombe, J., Fixsen, BR, Sakai, M., Li , RZ, Fields, H., Mokry, M., Tsai, RG, Bejar, R., Prange, K., de Winther, M., Sombra, GS, Vidrio, CK La ADN metiltransferasa 3 alfa y la TET metilcitosina dioxigenasa 2 restringen la señalización de interferón mediada por ADN mitocondrial en los macrófagos. (2022) Inmunidad. DOI: 10.1016/j.inmune.2022.06.022

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Hancock-Cerutti, W., Wu, Z., Xu, P., Yadavalli, N., Leonzino, M., Tharkeshwar, AK, Ferguson, SM, Sombra, GS, De Camilli, P. La proteína de transferencia de lípidos del lisosoma ER VPS13C/PARK23 previene la señalización aberrante de STING dependiente de mtDNA (2022) Revista de Biología Celular. 221(7):e202106046. DOI: DOI: 10.1083/jcb.202106046

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Xian, H., Watari, K., Sánchez-López, E., Offenberger, J., Onyuru, J., Sampath, H., Ying, W., Hoffman, HM, Sombra, GS, Karina, M. Los fragmentos de ADN oxidados salen de las mitocondrias a través de canales dependientes de mPTP y VDAC para activar el inflamasoma NLRP3 y la señalización del interferón. (2022) Inmunidad. DOI: 10.1016/j.inmune.2022.06.007

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Hepokoski, ML, Odish, MF, Lam, MT, Coufal, NG, Rolfsen, ML, Sombra, GS, Moyzis, AG, Sainz, AG, Takiar, PG, Patel, S., Leonard, AJ, Samandari, N., Hansen, E., Trescott, S., Nguyen, C., Jepsen, K., Cutter, G ., Gillespie, MN, Spragg, RG, Sasik, R., Ix, JH La cuantificación absoluta del ADN mitocondrial en plasma mediante PCR digital de gotitas marca la gravedad de la COVID-19 a lo largo del tiempo durante los ingresos en la unidad de cuidados intensivos. (2022) Soy J Physiol Lung Cell Mol Physiol. DOI: 10.1152/ajplung.00128.2022

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El aumento de las concentraciones de ADN mitocondrial en plasma se asocia con malos resultados en múltiples enfermedades críticas, incluida la COVID-19. Sin embargo, los métodos actuales de cuantificación de ADN mitocondrial libre de células en plasma requieren mucho tiempo y carecen de reproducibilidad. Aquí, utilizamos la secuenciación de próxima generación para caracterizar el tamaño y la ubicación del genoma del ADN mitocondrial circulante en sujetos gravemente enfermos con COVID-19 para desarrollar un método fácil y óptimo de cuantificación mediante PCR digital de gotas. La secuenciación reveló un gran porcentaje de pequeños fragmentos de ADN mitocondrial en plasma con una amplia variabilidad en la cobertura por ubicación del genoma. Identificamos sondas para los genes del ADN mitocondrial, el citocromo B y la NADH deshidrogenasa 1, en regiones de cobertura relativamente alta que se dirigen a secuencias pequeñas potencialmente perdidas por otros métodos. Luego se determinaron evaluaciones en serie de concentraciones absolutas de ADN mitocondrial en plasma de 20 sujetos gravemente enfermos con COVID-19 sin un paso de aislamiento de ADN. Las concentraciones de ADN mitocondrial el día de la inscripción aumentaron significativamente en pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) moderado o grave en comparación con aquellos sin SDRA o con SDRA leve. Las comparaciones de las concentraciones de ADN mitocondrial a lo largo del tiempo entre pacientes sin SDRA o leves que sobrevivieron, pacientes con SDRA moderado/grave que sobrevivieron y no sobrevivientes mostraron las concentraciones más altas en pacientes con enfermedad más grave. La cuantificación absoluta del ADN mitocondrial mediante PCR digital de gotitas es eficiente en el tiempo y reproducible; por lo tanto, proporcionamos una herramienta valiosa y una justificación para futuros estudios que evalúen el ADN mitocondrial como un biomarcador en tiempo real para guiar la toma de decisiones clínicas en sujetos gravemente enfermos con COVID-19.

2021

Sombra, GS, Adams, PD, Berggren, WT, Diedrich, JK, Diffenderfer, KE, Gage, FH, Hah, N., Hansen, M., Hetzer, MW, Molina, AJA, Manor, U., Marek, K., O Keefe, DD, Pinto, AFM, Sacco, A., Sharpee, TO, Shokriev, MN, Zambetti, S. El Nathan Shock Center de San Diego: abordar la heterogeneidad del envejecimiento. (2021) Gerociencia. DOI: 10.1007 / s11357-021-00426-x

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Comprender los mecanismos básicos del envejecimiento es una gran promesa para desarrollar intervenciones que prevengan o retrasen muchas enfermedades y declives relacionados con la edad simultáneamente para aumentar la salud humana. Sin embargo, un factor de confusión importante en la investigación sobre el envejecimiento es la heterogeneidad del propio proceso de envejecimiento. A nivel del organismo, está claro que la edad cronológica no siempre predice la edad biológica o la susceptibilidad a la fragilidad o la patología. Si bien la genética y el medio ambiente son los principales factores que impulsan las tasas variables de envejecimiento, surge una complejidad adicional porque los diferentes órganos, tejidos y tipos de células son intrínsecamente heterogéneos y exhiben diferentes trayectorias de envejecimiento normalmente o en respuesta a las tensiones del proceso de envejecimiento (p. ej., acumulación de daño) . Abordar la heterogeneidad del envejecimiento requiere herramientas nuevas y especializadas (p. ej., análisis unicelulares, enfoques basados en espectrometría de masas e imágenes avanzadas) para identificar firmas novedosas de envejecimiento en todas las escalas. Luego, se necesitan enfoques computacionales de vanguardia para integrar estos conjuntos de datos dispares y dilucidar las interacciones de red entre los sellos de envejecimiento conocidos. También existe la necesidad de modelos mejorados de envejecimiento basados en células humanas para garantizar que los hallazgos de la investigación básica sean relevantes para el envejecimiento humano y las intervenciones de salud. El Nathan Shock Center de San Diego (SD-NSC) brinda acceso a recursos científicos de vanguardia para facilitar el estudio de la heterogeneidad del envejecimiento en general y para promover el uso de nuevos modelos de células humanas del envejecimiento. El centro también cuenta con un sólido Núcleo de Desarrollo de Investigación que financia proyectos piloto sobre la heterogeneidad del envejecimiento y organiza actividades de capacitación innovadoras, incluidos talleres y un programa de tutoría personalizado, para ayudar a los investigadores nuevos en el campo del envejecimiento a tener éxito. Finalmente, el SD-NSC participa en actividades de divulgación para educar a la comunidad en general sobre la importancia de la investigación sobre el envejecimiento y promover la necesidad de la biología básica de la investigación sobre el envejecimiento en particular.

Wu, Z., Sainz, AG, Sombra, GS ADN mitocondrial: centinela de estrés genotóxico celular. (2021) Tendencias en Ciencias Bioquímicas. DOI: 10.1016/j.tibs.2021.05.004

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Tadepalle, N., Sombra, GS RNA informa noticias de última hora de las mitocondrias. (2021) célula molecular. 81(9):1863-1865. DOI: 10.1016/j.molcel.2021.04.005

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Lei, Y., Zhang, J., Schiavon, CR, He, M., Chen, L., Shen, H., Zhang, Y., Yin, Q., Cho, Y., Andrade, L., Sombra, GS, Hepokoski, M., Lei, T., Wang, H., Zhang, J., Yuan, JX, Malhotra, A., Manor, U., Wang, S., Yuan, ZY, Shyy, JY La proteína Spike del SARS-CoV-2 afecta la función endotelial a través de la regulación a la baja de ACE2. (2021) Investigación de la circulación. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318902

Schwartz, RE, Shokhirev, MN, Andrade, LR, Gutkind, JS, Iglesias-Bartolome, R., Sombra, GS Conocimientos sobre la senescencia de las células epiteliales a partir del análisis del transcriptoma y el secretoma de los queratinocitos orales humanos. (2021) Envejecimiento. 13. DOI: 10.18632/envejecimiento.202658

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Schiavon, Costa Rica, Sombra, GS, Mansión, U. Deterioro de la movilidad mitocondrial en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. (2021) Biol de desarrollo de células frontales. 9:624823. DOI: 10.3389/fcell.2021.624823

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2020

Schiavon, CR, Zhang, T., Zhao, B., Moore, AS, Wales, P., Andrade, LR, Wu, M., Sung, TC, Dayn, Y., Feng, JW, Quintero, OA, Sombra, GS, Grosse, R., Manor, U. Las imágenes de cromocuerpos de actina revelan la dinámica de la actina suborganelar. (2020) Métodos de la naturaleza. DOI: 10.1038/s41592-020-0926-5

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2019

Wu, Z., Oeck, S., West, AP, Mangalhara, KC, Sainz, AG, Newman, LE, Zhang, XO, Wu, L., Yan, Q., Bosenberg, M., Liu, Y., Sulkowski, PL, Tripple, V., Kaech, SM, Glazer, PM, Sombra, GS La señalización del estrés del ADN mitocondrial protege el genoma nuclear. [Publicado] (2019) Metabolismo de la naturaleza. 1(12):1209-1218. DOI: 10.1038/s42255-019-0150-8

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El genoma de los mamíferos comprende ADN nuclear (ADNn) derivado de ambos progenitores y ADN mitocondrial (ADNmt) que se hereda por vía materna y codifica proteínas esenciales requeridas para la fosforilación oxidativa. Miles de copias del mtDNA circular están presentes en la mayoría de los tipos de células que TFAM empaqueta en estructuras de orden superior llamadas nucleoides1. Las mitocondrias también son plataformas para la señalización antiviral2 y, debido a su origen bacteriano, el mtDNA y otros componentes mitocondriales desencadenan respuestas inmunitarias innatas y patología inflamatoria. Anteriormente mostramos que la inestabilidad y la liberación citoplasmática de mtDNA activa la vía cGAS-STING-TBK1, lo que da como resultado la expresión del gen estimulado por interferón (ISG) que promueve la inmunidad antiviral4. Aquí, encontramos que el estrés persistente del mtDNA no está asociado con la señalización de NF-κB basalmente activada o la expresión génica de interferón típica de una respuesta antiviral aguda. En cambio, un subconjunto específico de ISG, que incluye , permanece activado por la forma no fosforilada de ISGF3 (U-ISGF3) que mejora las respuestas de daño y reparación del ADNn. En fibroblastos primarios cultivados y células cancerosas, el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina causa daño y liberación de mtDNA, lo que conduce a la activación de ISG dependiente de cGAS-STING. Además, el estrés del mtDNA en células de melanoma de ratón deficientes en TFAM produce tumores que son más resistentes a la doxorrubicina. Finalmente, los ratones expuestos a radiación ionizante exhiben respuestas mejoradas de reparación de ADNn en el bazo. Por lo tanto, proponemos que el daño y la posterior liberación de mtDNA provoca una respuesta de señalización protectora que mejora la reparación de nDNA en células y tejidos, lo que sugiere que mtDNA es un centinela de estrés genotóxico.

Gale, M., Li, Y., Cao, J., Liu, ZZ, Holmbeck, MA, Zhang, M., Lang, SM, Wu, L., Do Carmo, M., Gupta, S., Aoshima, K., DiGiovanna, MP, Stern, DF, Rimm, DL, Sombra, GS, Chen, X, Yan, Q. La resistencia adquirida a las terapias dirigidas a HER2 genera vulnerabilidad a la inhibición de la ATP sintasa. (2019) Investigación sobre el cáncer. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3985

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Harel, M., Ortenberg, R., Varanasi, SK, Mangalhara, KC, Mardamshina, M., Markovits, E., Baruch, EN, Tripple, V., Arama-Chayoth, M., Greenberg, E., Shenoy , A., Ayasun, R., Knafo, N., Xu, S., Anafi, L., Yanovich-Arad, G., Barnabas, GD, Ashkenazi, S., Besser, MJ, Schachter, J., Bosenberg , m, Sombra, GS, Barshack, I., Kaech, SM, Markel, G., Geiger, T. La proteómica de la respuesta del melanoma a la inmunoterapia revela dependencia mitocondrial. (2019) Cell. DOI: 10.1016/j.cell.2019.08.012

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2018

Mangalhara, Kansas, Sombra, GS Un péptido derivado de mitocondrias ejerce la opción nuclear. (2018) Metabolismo Celular. 28(3):330-331. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.08.017

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Newman, LE, Sombra, GS Pink1/Parkin vinculan la inflamación, el estrés mitocondrial y la neurodegeneración. (2018) Revista de Biología Celular. 217(10):3327-3329. DOI: 10.1083/jcb.201808118

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Cox, CS, McKay, SE, Holmbeck, MA, Christian, BE, Scortea, AC, Tsay, AJ, Newman, LE, Sombra, GS Mitohormesis en ratones a través de la activación basal sostenida de la señalización mitocondrial y antioxidante. (2018) Metabolismo Celular. 28(5):776-786. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.07.011

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Wu, L., Cao, J., Cai, WL, Lang, SM, Horton, JR, Jansen, DJ, Liu, ZZ, Chen, JF, Zhang, M., Mott, BT, Pohida, K., Rai, G., Kales, SC, Henderson, MJ, Hu, X., Jadhav, A., Maloney, DJ, Simeonov, A., Zhu, S., Iwasaki, A., Hall, MD, Cheng, X., Sombra, GS, Yan, Q. Las histonas desmetilasas KDM5 reprimen la respuesta inmunitaria a través de la supresión de STING. (2018) PLOS Biología. 16(8):e2006134. DOI: 10.1371/journal.pbio.2006134

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Zhang, Y., Lee, JH, Paull, TT, Gehrke, S., D'Alessandro, A., Dou, Q., Gladyshev, VN, Schroeder, EA, Steyl, SK, Christian, BE, Sombra, GS La detección redox mitocondrial por parte de la quinasa ATM mantiene la capacidad antioxidante celular. (2018) Señalización científica. 11(538). DOI: 10.1126/scisignal.aaq0702

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Las mitocondrias son parte integral del metabolismo energético celular y la producción de ATP y están involucradas en la regulación de muchos procesos celulares. Las mitocondrias producen especies reactivas de oxígeno (ROS), que no solo pueden dañar los componentes celulares, sino que también participan en la transducción de señales. La cinasa ATM, que está mutada en la enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva ataxia-telangiectasia (AT), es un actor clave en la respuesta al daño del ADN nuclear. Sin embargo, ATM también realiza una función de detección redox mediada por la formación de dímeros unidos por disulfuro dependientes de ROS. Descubrimos que el peróxido de hidrógeno derivado de mitocondrias promovía la dimerización de ATM. En las células HeLa, los dímeros ATM se localizaron en el núcleo y fueron inhibidos por la proteína reguladora redox tiorredoxina 1 (TRX1), lo que sugiere la existencia de un relé de señalización de estrés mediado por ROS desde las mitocondrias hasta el núcleo. La formación del dímero ATM no afectó su asociación con la cromatina en ausencia o presencia de daño en el ADN nuclear, de acuerdo con la separación de sus funciones de señalización de daño en el ADN y redox. El análisis comparativo de las células U2OS que expresan ATM de tipo salvaje o el mutante C2991L con detección redox deficiente reveló que una función de la detección redox de ATM es promover el flujo de glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato (PPP) aumentando la abundancia y la actividad de la glucosa-6 -fosfato deshidrogenasa (G6PD), aumentando así la capacidad antioxidante celular. El PPP produce la coenzima NADPH necesaria para una respuesta antioxidante sólida, incluida la regeneración de TRX1, lo que indica la existencia de un circuito de retroalimentación regulatorio que involucra a ATM y TRX1. Proponemos que la pérdida de la función de detección de ROS mitocondrial de ATM puede causar acumulación de ROS celular y estrés oxidativo en AT.

Kuszak, AJ, Espey, MG, Falk, MJ, Holmbeck, MA, Manfredi, G., Sombra, GS, Vernon, HJ, Zolkipli-Cunningham, Z. Intervenciones nutricionales para las deficiencias mitocondriales de OXPHOS: mecanismos y sistemas modelo. (2018) Revisión Anual de Patología. 13(163-191):163-191. DOI: 10.1146/annurev-pathol-020117-043644

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2017

Oeste, AP, Sombra, GS ADN mitocondrial en respuestas inmunes innatas y patología inflamatoria. (2017) Reseñas de la naturaleza. Inmunología. 17(6):363-375. DOI: 10.1038/nri.2017.21

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Schweppe, DK, Chavez, JD, Lee, CF, Caudal, A., Kruse, SE, Stuppard, R., Marcinek, DJ, Sombra, GS, Tian, R., Bruce, JE Interactoma de proteína mitocondrial dilucidado por espectrometría de masas de reticulación química. (2017) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 114(7):1732-1737. DOI: 10.1073/pnas.1617220114

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2016

Oran, AR, Adams, CM, Zhang, XY, Gennaro, VJ, Pfeiffer, HK, Mellert, HS, Seidel, HE, Mascioli, K., Kaplan, J., Gaballa, MR, Shen, C., Rigoutsos, I ., King, MP, Cotney, JL, Arnold, JJ, Sharma, SD, Martinez-Outschoorn, UE, Vakoc, CR, Chodosh, LA, Thompson, JE, Bradner, JE, Cameron, CE, Sombra, GS, Eischen, CM, McMahon, SB El control multifocal de la expresión génica mitocondrial por MYC oncogénico proporciona objetivos terapéuticos potenciales en el cáncer. (2016) Oncoobjetivo. 7(45):72395-72414. DOI: 10.18632/oncotarget.11718

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Kang, MJ, Sombra, GS Una perspectiva mitocondrial de la patogenia de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. (2016) Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias. 79(4):207-213. DOI: 10.4046/trd.2016.79.4.207

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Holmbeck, MA, Sombra, GS Las mitocondrias proporcionan una solución 'compleja' a un problema bacteriano. (2016) Inmunología de la naturaleza. 17(9):1009-10. DOI: 10.1038/ni.3534

Nouws, J., Goswami, AV, Bestwick, M., McCann, BJ, Surovtseva, YV, Sombra, GS La proteína ribosómica mitocondrial L12 es necesaria para la estabilidad de POLRMT y existe como dos formas generadas por proteólisis alternativa durante la importación. (2016) Revista de Química Biológica. 291(2):989-97. DOI: 10.1074/jbc.M115.689299

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2015

McKay, SE, Yan, W., Nouws, J., Thormann, MJ, Raimundo, N., Khan, A., Santos-Sacchi, J., Song, L., Sombra, GS Patología auditiva en un modelo de ratón transgénico mtTFB1 de sordera mitocondrial. (2015) Soy. J. Pathol. 185(12):3132-40. DOI: 10.1016/j.ajpath.2015.08.014

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Camell, CD, Nguyen, KY, Jurczak, MJ, Christian, BE, Shulman, GI, Sombra, GS, Dixit, VD La síntesis de novo específica de macrófagos de ceramida es prescindible para la inflamación impulsada por inflamasomas y la resistencia a la insulina en la obesidad. (2015) Revista de Química Biológica. 290(49):29402-13. DOI: 10.1074/jbc.M115.680199

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La sobrecarga de lípidos en la dieta y el exceso de calorías durante la obesidad es un estado inflamatorio crónico de bajo grado con capacidad disminuida para metabolizar adecuadamente la glucosa o los lípidos. Los macrófagos son fundamentales para mantener la homeostasis del tejido adiposo, en parte al regular el metabolismo de los lípidos, la homeostasis energética y la remodelación de los tejidos. Durante la obesidad inducida por una dieta rica en grasas, los macrófagos se activan mediante "señales de peligro" derivadas de los lípidos, como las ceramidas y el palmitato, y promueven la inflamación del tejido adiposo de una manera dependiente del inflamasoma Nlrp3. Dado que el destino metabólico de los ácidos grasos en los macrófagos no está del todo dilucidado, hemos planteado la hipótesis de que se requiere la síntesis de novo de ceramida, a través de la enzima limitante de la velocidad serina palmitoiltransferasa de cadena larga (Sptlc)-2, para Nlrp3 impulsado por ácidos grasos saturados. Activación del inflamasoma en macrófagos. Aquí informamos que la sobreexpresión dirigida mitocondrial de catalasa, que se establece para mitigar el estrés oxidativo, controla la activación del inflamasoma Nlrp3 inducida por ceramida pero no afecta la escisión de caspasa-1 mediada por ATP. Sorprendentemente, la eliminación específica de células mieloides de Sptlc2 no es necesaria para la activación del inflamasoma Nlrp3 impulsada por palmitato. Además, la ablación de Sptlc2 en los macrófagos no afectó la polarización de los macrófagos ni la leucocitosis del tejido adiposo inducida por la obesidad. De acuerdo con estos datos, la investigación de la resistencia a la insulina utilizando pinzas hiperinsulinémicas-euglucémicas no reveló diferencias significativas en ratones obesos que carecían de maquinaria de síntesis de ceramida de novo en macrófagos. Estos datos sugieren que vías metabólicas alternativas controlan la síntesis de ceramidas derivadas de ácidos grasos en macrófagos y la activación del inflamasoma Nlrp3 en la obesidad.

Sombra, GS, Horvath, TL Señalización de ROS mitocondrial en la homeostasis del organismo. (2015) Cell. 163(3):560-9. DOI: 10.1016/j.cell.2015.10.001

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Longo, VD, Antebi, A., Bartke, A., Barzilai, N., Brown-Borg, HM, Caruso, C., Curiel, TJ, de Cabo, R., Franceschi, C., Gems, D., Ingram, DK, Johnson, TE, Kennedy, BK, Kenyon, C., Klein, S., Kopchick, JJ, Lepperdinger, G., Madeo, F., Mirisola, MG, Mitchell, JR, Passarino, G., Rudolph , KL, Sedivy, JM, Sombra, GS, Sinclair, DA, Spindler, SR, Suh, Y., Vijg, J., Vinciguerra, M., Fontana, L. Intervenciones para retardar el envejecimiento en humanos: ¿estamos preparados? (2015) Envejecimiento celular. 14(4):497-510. DOI: 10.1111/acel.12338

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Kang, MJ, Yoon, CM, Kim, BH, Lee, CM, Zhou, Y., Sauler, M., Homer, R., Dhamija, A., Boffa, D., West, AP, Sombra, GS, Ting, JP, Tedrow, JR, Kaminski, N., Kim, WJ, Lee, CG, Oh, YM, Elias, JA Supresión de NLRX1 en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. (2015) Revista de investigación clínica. 125(6):2458-62. DOI: 10.1172/JCI71747

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2014

Rongvaux, A., Jackson, R., Harman, CC, Li, T., West, AP, de Zoete, MR, Wu, Y., Yordy, B., Lakhani, SA, Kuan, CY, Taniguchi, T. , Sombra, GS, Chen, ZJ, Iwasaki, A., Flavell, RA Las caspasas apoptóticas previenen la inducción de interferones tipo I por el ADN mitocondrial. (2014) Cell. 159(7):1563-77. DOI: 10.1016/j.cell.2014.11.037

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Clayton, DA, Sombra, GS Aislamiento de mitocondrias de células y tejidos. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.top074542. DOI: 10.1101/pdb.top074542

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Clayton, DA, Sombra, GS Purificación de mitocondrias por centrifugación en gradiente de densidad escalonada de sacarosa. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080028. DOI: 10.1101/pdb.prot080028

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Clayton, DA, Sombra, GS Aislamiento de mitocondrias a partir de tejido animal. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080010. DOI: 10.1101/pdb.prot080010

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Clayton, DA, Sombra, GS Aislamiento de mitocondrias a partir de células de cultivo de tejidos. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080002. DOI: 10.1101/pdb.prot080002

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Ahora, J., Sombra, GS microgestión de la traducción mitocondrial. (2014) Cell. 158(3):477-8. DOI: 10.1016/j.cell.2014.07.010

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Sombra, GS Vive más tiempo en MARS: un paradigma de levadura de señalización ROS adaptativa mitocondrial en el envejecimiento. (2014) Célula microbiana. 1(5):140-144. DOI: 10.15698/mic2014.05.143

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Mannam, P., Shinn, AS, Srivastava, A., Neamu, RF, Walker, WE, Bohanon, M., Merkel, J., Kang, MJ, Dela Cruz, CS, Ahasic, AM, Pisani, MA, Trentalange , M., Oeste, AP, Sombra, GS, Elías, JA, Lee, PJ MKK3 regula la biogénesis mitocondrial y la mitofagia en la lesión pulmonar inducida por sepsis. (2014) Soy. J. Physiol. Mol de células pulmonares. Fisiol. 306(7):L604-19. DOI: 10.1152/ajplung.00272.2013

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cristiano, ser, Sombra, GS Envejecimiento: SIRTainly es posible restaurar la disfunción mitocondrial. (2014) Biología actual. 24(5):R206-8. DOI: 10.1016/j.cub.2014.01.027

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Schroeder, EA, Sombra, GS La diafonía entre las señales de estrés mitocondrial regula la vida cronológica de la levadura. (2014) Mech Envejecimiento Dev. 135:41-9. DOI: 10.1016/j.mad.2013.12.002

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Sharma, NK, Lebedeva, M., Thomas, T., Kovalenko, OA, Stumpf, JD, Sombra, GS, Santos, JH Defectos intrínsecos de reparación del ADN mitocondrial en Ataxia Telangiectasia. (2014) Reparación de ADN. 13:22-31. DOI: 10.1016/j.dnarep.2013.11.002

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2013

Schroeder, EA, Raimundo, N., Sombra, GS El silenciamiento epigenético media la longevidad inducida por el estrés de las mitocondrias. (2013) Metabolismo Celular. 17(6):954-64. DOI: 10.1016/j.cmet.2013.04.003

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Bestwick, ML, Sombra, GS Complementando la maquinaria de transcripción mitocondrial humana. (2013) Tendencias en Ciencias Bioquímicas. 38(6):283-91. DOI: 10.1016/j.tibs.2013.03.006

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Surovtseva, YV, Sombra, GS Papel independiente de la transcripción de la polimerasa de ARN mitocondrial humano en la biogénesis del ribosoma mitocondrial. (2013) Investigación de ácidos nucleicos. 41(4):2479-88. DOI: 10.1093/nar/gks1447

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2012

Ocampo, A., Liu, J., Schroeder, EA, Sombra, GS, Barrientos, A. Los umbrales respiratorios mitocondriales regulan la vida cronológica de la levadura y su extensión por restricción calórica. (2012) Metabolismo Celular. 16(1):55-67. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.05.013

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Longo, VD, Sombra, GS, Kaeberlein, M., Kennedy, B. Envejecimiento replicativo y cronológico en Saccharomyces cerevisiae. (2012) Metabolismo Celular. 16(1):18-31. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.06.002

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Lodeiro, MF, Uchida, A., Bestwick, M., Moustafa, IM, Arnold, JJ, Sombra, GS, Cameron, CE La transcripción del segundo promotor de cadena pesada del mtDNA humano es reprimida por el factor de transcripción A in vitro. (2012) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 109(17):6513-8. DOI: 10.1073/pnas.1118710109

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Los estudios basados en células respaldan la existencia de dos promotores en la hebra pesada del mtDNA: el promotor 1 de hebra pesada (HSP1) y HSP2. Sin embargo, la transcripción de HSP2 se ha informado solo una vez en un sistema libre de células y nunca cuando se han utilizado proteínas recombinantes. Aquí, documentamos la transcripción de HSP2 utilizando un sistema in vitro de composición definida. Una plantilla de oligonucleótidos que representaba las posiciones 596-685 del mtDNA fue suficiente para observar la transcripción por la mtRNA polimerasa humana (POLRMT) que dependía absolutamente del factor de transcripción mitocondrial B2 (TFB2M). La transcripción dependiente de POLRMT/TFB2M fue inhibida por concentraciones estequiométricas del factor A de transcripción mitocondrial (TFAM) con la plantilla de transcripción, una condición que activa la transcripción del promotor de cadena ligera (LSP) in vitro. Los dominios de TFAM requeridos para la activación de LSP también se requerían para la represión de HSP2, mientras que otras proteínas de unión a mtDNA no lograron alterar la producción transcripcional. Los sitios de unión para TFAM se ubicaron en ambos lados del sitio de inicio de la transcripción de HSP2, lo que sugiere que la unión de TFAM interfiere con la unión de POLRMT y/o TFB2M. De acuerdo con un modelo de unión competitiva para la represión de TFAM de HSP2, el impacto de la concentración de TFAM en la transcripción de HSP2 disminuyó al elevar las concentraciones de POLRMT y TFB2M. En el contexto de nuestros estudios previos de LSP y HSP1, ahora está claro que existen tres promotores en el ADNmt humano. Cada promotor tiene un requisito único y/o una respuesta al nivel de TFAM presente, lo que implica una complejidad mucho mayor en la regulación de la transcripción mitocondrial de mamíferos que la reconocida hasta la fecha.

Schroeder, EA, Sombra, GS El combustible mitocondrial alternativo prolonga la vida útil. (2012) Metabolismo Celular. 15(4):417-8. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.03.011

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Raimundo, N., Song, L., Shutt, TE, McKay, SE, Cotney, J., Guan, MX, Gilliland, TC, Hohuan, D., Santos-Sacchi, J., Sombra, GS El estrés mitocondrial involucra la señalización apoptótica de E2F1 para causar sordera. (2012) Cell. 148(4):716-26. DOI: 10.1016/j.cell.2011.12.027

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Woo, DK, Green, PD, Santos, JH, D'Souza, AD, Walther, Z., Martin, WD, Christian, BE, Chandel, NS, Sombra, GS La inestabilidad del genoma mitocondrial y las ROS mejoran la tumorigénesis intestinal en ratones APC(Min/+). (2012) Soy. J. Pathol. 180(1):24-31. DOI: 10.1016/j.ajpath.2011.10.003

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Las alteraciones en la fosforilación oxidativa mitocondrial se han documentado durante mucho tiempo en los tumores. Otros tipos de disfunción mitocondrial, incluida la producción alterada de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la apoptosis, también pueden contribuir a la tumorigénesis y los fenotipos de cáncer. Además, se han observado mutaciones y cantidades alteradas de ADN mitocondrial (ADNmt) en células cancerosas. Sin embargo, la forma en que la inestabilidad del mtDNA per se contribuye al cáncer sigue siendo en gran parte indeterminada. El factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) es necesario para la expresión y el mantenimiento del mtDNA. Los ratones Tfam heterocigotos knock-out (Tfam(+/-)) muestran una disminución leve del ADNmt, pero no tienen fenotipos manifiestos. Mostramos que las células y los tejidos de ratón Tfam (+/-) no solo poseen menos ADNmt sino que también aumentan el daño oxidativo del ADNmt. El cruce de ratones Tfam(+/-) con el modelo de cáncer de ratón de neoplasia intestinal múltiple de poliposis coli adenomatosa (APC(Min/+)) reveló que la inestabilidad del mtDNA aumenta el número de tumores y el crecimiento en el intestino delgado. Esto no fue el resultado de la mejora de la señalización de Wnt/β-catenina, sino que parece implicar una propensión a aumentar la producción de ROS mitocondrial. La participación directa de las ROS mitocondriales en la tumorigénesis intestinal se demostró al cruzar ratones APC (Min/+) con aquellos que tenían catalasa dirigida a las mitocondrias, lo que resultó en una reducción significativa de la tumorigénesis en el colon. Por lo tanto, la inestabilidad del genoma mitocondrial y las ROS mejoran la tumorigénesis intestinal y los ratones Tfam (+/-) son un modelo relevante para abordar el papel de la inestabilidad del ADNmt en estados patológicos en los que está implicada la disfunción mitocondrial, como el cáncer, la neurodegeneración y el envejecimiento.

Malarkey, CS, Bestwick, M., Kuhlwilm, JE, Sombra, GS, Churchill, Estados Unidos La activación transcripcional por el factor A de transcripción mitocondrial implica una distorsión preferencial del ADN promotor. (2012) Investigación de ácidos nucleicos. 40(2):614-24. DOI: 10.1093/nar/gkr787

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2011

Liu, L., Sanosaka, M., Lei, S., Bestwick, ML, Frey, JH, Surovtseva, YV, Sombra, GS, Cooper, parlamentario La proteína LRP130 remodela las mitocondrias y estimula la oxidación de ácidos grasos. (2011) Revista de Química Biológica. 286(48):41253-64. DOI: 10.1074/jbc.M111.276121

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Surovtseva, YV, Shutt, TE, Cotney, J., Cimen, H., Chen, SY, Koc, EC, Sombra, GS La proteína ribosómica mitocondrial L12 se asocia selectivamente con la ARN polimerasa mitocondrial humana para activar la transcripción. (2011) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 108(44):17921-6. DOI: 10.1073/pnas.1108852108

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La transcripción basal del ADN mitocondrial humano (ADNmt) in vitro requiere la ARN polimerasa relacionada con bacteriófagos de una sola subunidad, POLRMT y el factor de transcripción h-mtTFB2. Este sistema de dos componentes se activa diferencialmente en los promotores de mtDNA por el factor A de transcripción mitocondrial humano (h-mtTFA). La proteína ribosómica mitocondrial L7/L12 (MRPL12) se une directamente a POLRMT, pero se desconoce si lo hace en el contexto del ribosoma o como una proteína "libre" en la matriz. Además, la evidencia existente de que MRPL12 activa la transcripción mitocondrial se deriva de estudios de sobreexpresión en células cultivadas y experimentos de transcripción que utilizan lisados mitocondriales crudos, lo que impide que se asignen efectos directos de MRPL12 en la transcripción. Aquí, informamos que el agotamiento de MRPL12 de las células HeLa por shRNA da como resultado una disminución de los niveles de transcripciones mitocondriales en estado estacionario, que no se explican por los cambios en la estabilidad del ARN. También mostramos que existe un grupo "libre" significativo de MRPL12 en las mitocondrias humanas no asociado con los ribosomas. MRPL12 "libre" se une selectivamente a POLRMT in vivo en un complejo distinto de los que contienen h-mtTFB2. Finalmente, utilizando un sistema de transcripción mitocondrial completamente recombinante, demostramos que MRPL12 estimula la transcripción dependiente e independiente del promotor directamente in vitro. Con base en estos resultados, proponemos que, cuando no está asociado con los ribosomas, MRPL12 tiene una segunda función en la transcripción, quizás actuando para facilitar la transición de la iniciación a la elongación. Especulamos que este es un mecanismo para coordinar la biogénesis y la transcripción de los ribosomas mitocondriales en las mitocondrias humanas, donde la transcripción de los ARNr del ADNmt presumiblemente debe ajustarse de acuerdo con la tasa de importación y ensamblaje de los MRP codificados por núcleo en los ribosomas.

Baysal, BE, McKay, SE, Kim, YJ, Zhang, Z., Alila, L., Willett-Brozick, JE, Pacak, K., Kim, TH, Sombra, GS Impresión genómica en un elemento límite que flanquea el locus SDHD. (2011) Genética Molecular Humana. 20(22):4452-61. DOI: 10.1093/hmg/ddr376

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Raimundo, N., Baysal, BE, Sombra, GS Revisando el ciclo de TCA: señalización para la formación de tumores. (2011) Tendencias en Medicina Molecular. 17(11):641-9. DOI: 10.1016/j.molmed.2011.06.001

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Pan, Y., Schroeder, EA, Ocampo, A., Barrientos, A., Sombra, GS Regulación de la vida cronológica de la levadura por TORC1 a través de la señalización ROS mitocondrial adaptativa. (2011) Metabolismo Celular. 13(6):668-78. DOI: 10.1016/j.cmet.2011.03.018

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Oeste, AP, Sombra, GS, Ghosh, S. Las mitocondrias en las respuestas inmunes innatas. (2011) Reseñas de la naturaleza. Inmunología. 11(6):389-402. DOI: 10.1038/nri2975

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Chatenay-Lapointe, M., Sombra, GS Represión de la traducción mitocondrial, la respiración y un gen regulado por el ciclo metabólico, SLF1, por la proteína Puf3p de la familia Pumilio de levadura. (2011) Más uno. 6(5):e20441. DOI: 10.1371/journal.pone.0020441

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La síntesis y el ensamblaje del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) requiere genes ubicados tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial, pero no se comprende completamente cómo se coordina la expresión génica entre estos dos compartimentos. Un nivel de control es a través de proteínas ribosómicas mitocondriales de expresión regulada y otros factores necesarios para la traducción mitocondrial y el ensamblaje de OXPHOS, que son todos productos de genes nucleares que posteriormente se importan a las mitocondrias. Curiosamente, este cuadro de genes en la levadura en ciernes tiene en común un elemento 3'-UTR que se une a la proteína de la familia Pumilio, Puf3p, y se regula de manera coordinada en muchas condiciones, incluso durante el ciclo metabólico de la levadura. Se han asignado múltiples funciones a Puf3p, incluida la promoción de la degradación del ARNm, la localización de las transcripciones mitocondriales codificadas por el núcleo en la membrana mitocondrial externa y la facilitación de las interacciones y la motilidad mitocondria-citoesquelético. Aquí mostramos que Puf3p tiene un efecto represivo general sobre la abundancia, la traducción y la respiración de OXPHOS mitocondrial que no implica cambios en la biogénesis mitocondrial general y es en gran medida independiente de la señalización mitocondrial TORC1. También identificamos el factor de traducción citoplasmático Slf1p como un gen regulado por el ciclo metabólico de la levadura que es reprimido por Puf3p a nivel postranscripcional y promueve la respiración y la extensión de la vida cronológica de la levadura cuando se sobreexpresa. En conjunto, estos resultados deberían facilitar futuros estudios sobre cuál de las muchas funciones de Puf3p es más relevante para regular la expresión génica mitocondrial y el papel de la comunicación nuclear-mitocondrial en el envejecimiento y la longevidad.

West, AP, Brodsky, IE, Rahner, C., Woo, DK, Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, MC, Choi, Y., Sombra, GS, Ghosh, S. La señalización de TLR aumenta la actividad bactericida de los macrófagos a través de ROS mitocondriales. (2011) Naturaleza. 472 (7344): 476-80. DOI: 10.1038/naturaleza09973

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Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son componentes esenciales de la respuesta inmune innata contra las bacterias intracelulares y se cree que los fagocitos profesionales generan ROS principalmente a través de la maquinaria fagosomal NADPH oxidasa. Sin embargo, estudios recientes han sugerido que las ROS mitocondriales (mROS) también contribuyen a la actividad bactericida de los macrófagos de ratón, aunque los mecanismos que vinculan la señalización inmunitaria innata a las mitocondrias para la generación de mROS siguen sin estar claros. Aquí demostramos que la participación de un subconjunto de receptores tipo Toll (TLR1, TLR2 y TLR4) da como resultado el reclutamiento de mitocondrias a fagosomas de macrófagos y aumenta la producción de mROS. Esta respuesta implica la translocación de un adaptador de señalización TLR, el factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF6), a las mitocondrias, donde se acopla a la proteína ECSIT (intermedio de señalización conservado evolutivamente en las vías Toll), que está implicada en el ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial. La interacción con TRAF6 conduce a la ubiquitinación y enriquecimiento de ECSIT en la periferia mitocondrial, lo que resulta en una mayor generación de ROS mitocondrial y celular. Los macrófagos agotados en ECSIT y TRAF6 tienen niveles reducidos de ROS inducidos por TLR y su capacidad para matar bacterias intracelulares está significativamente disminuida. Además, la reducción de los niveles de mROS de macrófagos mediante la expresión de catalasa en las mitocondrias da como resultado una destrucción bacteriana defectuosa, lo que confirma el papel de mROS en la actividad bactericida. Estos resultados revelan una nueva vía que vincula la señalización inmunitaria innata con las mitocondrias, implican a mROS como un componente importante de las respuestas antibacterianas y establecen aún más a las mitocondrias como centros para la señalización inmunitaria innata.

Shutt, TE, Bestwick, M., Sombra, GS El complejo básico de iniciación de la transcripción mitocondrial humana: solo se necesitan dos para bailar tango. (2011) Transcripción. 2(2):55-59. DOI: 10.4161/trns.2.2.14296

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Guau, DK, Sombra, GS Las señales de estrés mitocondrial revisan una vieja teoría del envejecimiento. (2011) Cell. 144(1):11-2. DOI: 10.1016/j.cell.2010.12.023

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2010

Lee, HY, Choi, CS, Birkenfeld, AL, Alves, TC, Jornayvaz, FR, Jurczak, MJ, Zhang, D., Woo, DK, Sombra, GS, Ladiges, W., Rabinovitch, PS, Santos, JH, Petersen, KF, Samuel, VT, Shulman, GI La expresión dirigida de catalasa a las mitocondrias previene las reducciones asociadas con la edad en la función mitocondrial y la resistencia a la insulina. (2010) Metabolismo Celular. 12(6):668-74. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.004

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Chatenay-Lapointe, M., Sombra, GS Las mitocondrias estresadas se ENOJAN. (2010) Metabolismo Celular. 12(6):559-60. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.018

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Shutt, TE, Lodeiro, MF, Cotney, J., Cameron, CE, Sombra, GS El aparato de transcripción mitocondrial humano central es un sistema regulado de dos componentes in vitro. (2010) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 107(27):12133-8. DOI: 10.1073/pnas.0910581107

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El aparato central de transcripción mitocondrial humana se considera actualmente como un sistema obligado de tres componentes que comprende la polimerasa de ARN mitocondrial relacionada con el bacteriófago T7, el factor de transcripción relacionado con la metiltransferasa de ARNr, h-mtTFB2, y el factor de empaquetamiento de ADN/transcripción de caja de grupo de alta movilidad , h-mtTFA/TFAM. Utilizando un fiel sistema de transcripción mitocondrial humano recombinante de Escherichia coli, demostramos que la iniciación específica de los promotores de ADNmt, LSP y HSP1, solo requiere ARN polimerasa mitocondrial y h-mtTFB2 in vitro. Cuando se agrega h-mtTFA a estos componentes basales, LSP exhibe un umbral de activación mucho más bajo y una respuesta de mayor amplitud que HSP1. Además, cuando LSP y HSP1 están juntos en la misma plantilla de transcripción, se mejora la transcripción independiente de h-mtTFA de HSP1 y la transcripción dependiente de h-mtTFA de ambos promotores y se requiere una mayor concentración de h-mtTFA para estimular HSP1. Los experimentos de competencia de promotores revelaron que, además de los componentes de transcripción que compiten con LSP lejos de HSP1, hay señales adicionales que actúan en cis involucradas en estos aspectos de la regulación del promotor. Con base en estos resultados, especulamos que el sistema de transcripción mitocondrial humano puede haber evolucionado para regular diferencialmente el inicio de la transcripción y la replicación del mtDNA cebado por la transcripción en respuesta a la cantidad de h-mtTFA asociado con los nucleoides, lo que podría comenzar a explicar la heterogeneidad de la estructura del nucleoide. y actividad in vivo. Además, este estudio arroja nueva luz sobre la evolución de los componentes de la transcripción mitocondrial al mostrar que el sistema humano es un sistema regulado de dos componentes in vitro y, por lo tanto, más parecido al de la levadura en ciernes de lo que se pensaba anteriormente.

Cállate, TE, Sombra, GS Un compendio de la maquinaria de expresión de genes mitocondriales humanos con vínculos con enfermedades. (2010) Mutagénesis Ambiental y Molecular. 51(5):360-79. DOI: 10.1002/em.20571

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2009

Pawar, V., Jingjing, L., Patel, N., Kaur, N., Doetsch, PW, Sombra, GS, Zhang, H., Siede, W. Fosforilación de la quinasa del punto de control en respuesta al daño oxidativo del ADN endógeno en Saccharomyces cerevisiae en fase estacionaria de reparación deficiente. (2009) Mech Envejecimiento Dev. 130(8):501-8. DOI: 10.1016/j.mad.2009.06.002

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Sombra, GS, Pan, Y. Regulación multifacética de las mitocondrias por TOR. (2009) Ciclo celular. 8(14):2143. DOI: 10.4161/cc.8.14.9117

Cotney, J., McKay, SE, Sombra, GS La elucidación de las funciones separadas pero colaborativas de los factores de transcripción mitocondriales humanos B1 y B2 relacionados con la rRNA metiltransferasa en la biogénesis mitocondrial revela una nueva visión de la pareja (2009) Genética Molecular Humana. 18(14):2670-82. DOI: 10.1093/hmg/ddp208

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Griffiths, LM, Doudican, NA, Sombra, GS, Doetsch, PW Daño oxidativo del ADN mitocondrial y mutagénesis en Saccharomyces cerevisiae. (2009) Métodos en Biología Molecular. 554:267-86. DOI: 10.1007/978-1-59745-521-3_17

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La mutación del ADN mitocondrial humano (ADNmt) se ha relacionado con trastornos neuromusculares heredados de la madre y está implicada en enfermedades más comunes como el cáncer, la diabetes y la enfermedad de Parkinson. Las mutaciones en el mtDNA también se acumulan con la edad y, por lo tanto, se cree que contribuyen al envejecimiento y a la patología relacionada con la edad. Alojado dentro de la matriz mitocondrial, el mtDNA codifica varias de las proteínas involucradas en la producción de ATP a través del proceso de fosforilación oxidativa, que implica el flujo de electrones de alta energía a través de la cadena de transporte de electrones (ETC). Debido a su proximidad al ETC, el mtDNA es altamente vulnerable al daño oxidativo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS) como el peróxido de hidrógeno, el superóxido y los radicales hidroxilo que este sistema produce constantemente. Por lo tanto, es importante poder medir el daño oxidativo del mtDNA en condiciones fisiológicas normales y durante el estrés ambiental o asociado a enfermedades. La levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es un sistema modelo fácil e informativo en el que estudiar dicho daño oxidativo del mtDNA porque es un anaerobio facultativo eucariótico unicelular que depende condicionalmente de la fosforilación oxidativa mitocondrial para la viabilidad. Aquí, describimos métodos para cuantificar el daño oxidativo del mtDNA y la mutagénesis en S. cerevisiae, varios de los cuales podrían aplicarse al desarrollo de ensayos similares en células y tejidos de mamíferos. Estos métodos incluyen la medición del número de mutaciones puntuales que se producen en el ADNmt con el ensayo de resistencia a la eritromicina, la cuantificación de la cantidad de daño oxidativo del ADN utilizando un ensayo de transferencia Southern modificado y la medición de la integridad del ADNmt con el ensayo de "inducción pequeña".

Crouser, ED, Shao, G., Julian, MW, Macre, JE, Sombra, GS, Tridandapani, S., Huang, Q., Wewers, MD La activación de monocitos por células necróticas es promovida por proteínas mitocondriales y receptores de péptidos de formilo. (2009) Medicina de Terapia Intensiva. 37(6):2000-9. DOI: 10.1097/CCM.0b013e3181a001ae

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Suissa, S., Wang, Z., Poole, J., Wittkopp, S., Feder, J., Shutt, TE, Wallace, DC, Sombra, GS, Mismar, D. Las variantes genéticas de mtDNA antiguas modulan la transcripción y replicación de mtDNA. (2009) Genética PLOS. 5(5):e1000474. DOI: 10.1371/journal.pgen.1000474

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Aunque las consecuencias funcionales de los antecedentes genéticos del ADN mitocondrial (ADNmt) (haplotipos, haplogrupos) han sido demostradas tanto por estudios de asociación de enfermedades como por experimentos de cultivos celulares, no está claro cuáles de las mutaciones dentro del haplogrupo tienen implicaciones funcionales y cuáles son "evolutivas silenciosas". autostopistas". Nos propusimos estudiar la funcionalidad de las mutaciones definitorias de haplogrupos dentro de la región reguladora de la transcripción/replicación del mtDNA mediante transcripción in vitro, con la hipótesis de que las mutaciones definitorias de haplogrupos que ocurren dentro de los motivos reguladores del mtDNA podrían afectar estos procesos. Por lo tanto, seleccionamos > 2500 ADNmt humanos completos que representan a todas las poblaciones principales en todo el mundo para la variación natural en los sitios de unión a proteínas establecidos experimentalmente y las regiones reguladoras que comprenden un total de 241 pb en cada ADNmt. Nuestra pantalla reveló 77/241 sitios que mostraban mutaciones puntuales que podrían dividirse en cambios no fijos (57/77, 74 %) y que definen haplogrupos/subhaplogrupos (es decir, cambios fijos en la población, 20/77, 26 %). La variante que define el haplogrupo J caucásico (C295T) aumentó la unión de TFAM (ensayo de cambio de movilidad eléctrica) y la capacidad de transcripción de la cadena L in vitro, especialmente de una transcripción más corta que se mapea inmediatamente aguas arriba del bloque de secuencia conservada 1 (CSB1), un región asociada con el cebado de ARN de la replicación de mtDNA. De acuerdo con este hallazgo, los cíbridos (es decir, células que comparten el mismo fondo genético nuclear pero que difieren en sus antecedentes de ADNmt) que albergan el ADNmt del haplogrupo J tuvieron un aumento de >2 veces en el número de copias de ADNmt, en comparación con los cíbridos que contienen el haplogrupo H, sin diferencias aparentes en niveles de estado estacionario de transcritos codificados por mtDNA. Por lo tanto, una mutación en la región reguladora del haplogrupo J afecta la replicación o la estabilidad del mtDNA, lo que puede explicar parcialmente el impacto fenotípico de este haplogrupo. Nuestro análisis demuestra, por lo tanto, por primera vez, el impacto funcional de mutaciones particulares de la región de control que definen haplogrupos de mtDNA, allanando el camino hacia la evaluación de la funcionalidad de variantes genéticas tanto fijas como no fijas en el genoma mitocondrial.

Lebedeva, MA, Eaton, JS, Sombra, GS La pérdida de p53 provoca el agotamiento del ADN mitocondrial y altera la homeostasis de las especies de oxígeno reactivo mitocondrial. (2009) Biochimica et Biophysica Acta. 1787(5):328-34. DOI: 10.1016/j.bbabio.2009.01.004

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Raimundo, N., Sombra, GS Una visión mitocondrial "radical" de la patología relacionada con la autofagia. (2009) Envejecimiento. 1(4):354-6. DOI: 10.18632/envejecimiento.100037

Tal, MC, Sasai, M., Lee, HK, Yordy, B., Sombra, GS, Iwasaki, A. La ausencia de autofagia da como resultado una amplificación dependiente de la especie de oxígeno reactivo de la señalización de RLR. (2009) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 106(8):2770-5. DOI: 10.1073/pnas.0807694106

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Pan, Y, Sombra, GS La extensión de la vida cronológica mediante la reducción de la señalización de TOR requiere una regulación a la baja de Sch9p e implica una mayor densidad del complejo mitocondrial OXPHOS. (2009) Envejecimiento. 1(1):131-45. DOI: 10.18632/envejecimiento.100016

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La vía de detección de nutrientes de la rapamicina (TOR) parece tener un papel conservado en la regulación de la duración de la vida. Esta red de señalización es compleja, con muchas salidas fisiológicas posteriores y, por lo tanto, los mecanismos subyacentes a sus efectos relacionados con la edad no se han dilucidado por completo. Anteriormente demostramos que la señalización reducida de TOR (cepas intor1Delta) extiende la vida cronológica de la levadura (CLS) al aumentar el consumo de oxígeno mitocondrial, en parte, al regular al alza la traducción de las subunidades de fosforilación oxidativa codificadas por mtDNA (OXPHOS). Aquí, hemos examinado con mayor detalle cómo la señalización TOR influye en la función mitocondrial y CLS y el papel de la quinasa Sch9p en la vía TOR-mitocondria. Como es el caso del consumo de oxígeno, la traducción mitocondrial se eleva en las cepas tor1Delta solo durante el crecimiento activo y los primeros puntos de crecimiento de la fase estacionaria. Esto se acompaña de un aumento correspondiente en la abundancia de subunidades OXPHOS codificadas por mtDNA y codificadas por núcleo por masa mitocondrial. Sin embargo, este aumento de la densidad del complejo OXPHOS no está asociado con más mitocondrias/células o ATP celular y conduce a una disminución general del potencial de membrana, lo que sugiere que la señalización de TOR puede influir en el desacoplamiento de la respiración. Finalmente, documentamos que la quinasa Sch9p es un efector clave aguas abajo de OXPHOS, ROS y CLS en la vía TOR-mitocondria. En conjunto, nuestros resultados demuestran que la señalización TOR tiene un papel global en la regulación de la dinámica y la función del proteoma mitocondrial que es importante por su papel en el envejecimiento y proporciona evidencia convincente de la participación de un efecto de "preacondicionamiento mitocondrial" en la determinación de CLS.

2008

Sombra, GS En la frontera salvaje de la enfermedad mitocondrial y el envejecimiento. (2008) Métodos. 46(4):239-40. DOI: 10.1016/j.ymeth.2008.10.027

Bonawitz, ND, Chatenay-Lapointe, M., Wearn, CM, Sombra, GS La expresión de la proteína mitocondrial Tar1p codificada por rDNA está estrictamente controlada y responde de manera diferencial a la demanda y disfunción respiratoria mitocondrial. (2008) Genética actual. 54(2):83-94. DOI: 10.1007/s00294-008-0203-0

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Sombra, GS Expresión y mantenimiento del ADN mitocondrial: nuevos conocimientos sobre la patología de enfermedades humanas. (2008) Soy. J. Pathol. 172(6):1445-56. DOI: 10.2353/ajpath.2008.071163

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Schleicher, M., Shepherd, BR, Suarez, Y., Fernandez-Hernando, C., Yu, J., Pan, Y., Acevedo, LM, Sombra, GS, Sessa, WC La prohibitina-1 mantiene la capacidad angiogénica de las células endoteliales al regular la función mitocondrial y la senescencia. (2008) Revista de Biología Celular. 180(1):101-12. DOI: 10.1083/jcb.200706072

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2007

Eaton, JS, Lin, ZP, Sartorelli, AC, Bonawitz, ND, Sombra, GS La quinasa mutada de ataxia-telangiectasia regula la ribonucleótido reductasa y la homeostasis mitocondrial. (2007) Revista de investigación clínica. 117(9):2723-34. DOI: 10.1172/JCI31604

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Lébedeva, MA, Sombra, GS Los cambios impulsados por el ciclo celular y la ribonucleótido reductasa en el número de copias de mtDNA influyen en la herencia de mtDNA sin comprometer la expresión génica mitocondrial. (2007) Ciclo celular. 6(16):2048-57. DOI: 10.4161/cc.6.16.4572

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La mayoría de los eucariotas mantienen múltiples copias de mtDNA, que van desde 20-50 en levaduras hasta 10,000 en células de mamíferos. El genoma mitocondrial codifica subunidades esenciales de la cadena respiratoria, pero el número de moléculas de mtDNA aparentemente excede el necesario para mantener una respiración adecuada, como lo demuestra el "efecto umbral" en las enfermedades mitocondriales. Por lo tanto, otras presiones selectivas aparentemente han contribuido al mantenimiento universal de múltiples moléculas de mtDNA/célula. Aquí analizamos la interacción entre las dos vías propuestas para regular el número de copias de mtDNA en Saccharomyces cerevisiae y el requisito de un número normal de copias de mtDNA para la expresión génica mitocondrial, la respiración y la herencia. Proporcionamos la primera evidencia directa de que se puede lograr la regulación positiva del mtDNA al aumentar la actividad de la ribonucleótido reductasa (RNR) a través de la desrepresión de la transcripción del gen RNR nuclear o la eliminación de la regulación de retroalimentación alostérica. El análisis de las cepas mutantes de rad53 también reveló una regulación al alza del número de copias de mtDNA independientemente del resultado de la actividad RNR elevada. Presentamos evidencia de que un ciclo celular prolongado permite la acumulación de mtDNA en estas cepas. El análisis de múltiples cepas con aumento o disminución de mtDNA reveló que existen mecanismos para prevenir cambios significativos en la expresión génica mitocondrial y la respiración frente a alteraciones de aproximadamente el doble en el número de copias de mtDNA. Sin embargo, el agotamiento de mtDNA en cepas nulas de abf2 conduce a una herencia defectuosa de mtDNA que se rescata parcialmente al reponer mtDNA a través de la sobreexpresión de RNR1. Estos resultados indican que una de las funciones de múltiples copias de mtDNA es garantizar una herencia óptima de mtDNA durante la división celular.

Bonawitz, Dakota del Norte, Sombra, GS Repensando la teoría mitocondrial del envejecimiento: el papel de la expresión génica mitocondrial en la determinación de la vida útil. (2007) Ciclo celular. 6(13):1574-8. DOI: 10.4161/cc.6.13.4457

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Cotney, J., Wang, Z., Sombra, GS Abundancia relativa del sistema de transcripción mitocondrial humano y roles distintos para h-mtTFB1 y h-mtTFB2 en la biogénesis mitocondrial y la expresión génica. (2007) Investigación de ácidos nucleicos. 35(12):4042-54. DOI: 10.1093/nar/gkm424

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Bonawitz, ND, Chatenay-Lapointe, M., Pan, Y., Sombra, GS La señalización reducida de TOR extiende la vida útil cronológica a través de una mayor respiración y regulación positiva de la expresión génica mitocondrial. (2007) Metabolismo Celular. 5(4):265-77. DOI: 10.1016/j.cmet.2007.02.009

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Wang, Z., Cotney, J., Sombra, GS La proteína ribosómica mitocondrial humana MRPL12 interactúa directamente con la ARN polimerasa mitocondrial para modular la expresión génica mitocondrial. (2007) Revista de Química Biológica. 282(17):12610-8. DOI: 10.1074/jbc.M700461200

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La maquinaria central de transcripción mitocondrial humana comprende una polimerasa de ARN relacionada con bacteriófagos de subunidad única, POLRMT, la proteína de unión a ADN de caja de grupo de alta movilidad h-mtTFA/TFAM, y dos proteínas coactivadoras transcripcionales, h-mtTFB1 y h-mtTFB2 que también tienen actividad rRNA metiltransferasa. La recapitulación del inicio específico de la transcripción in vitro puede lograrse mediante un complejo de POL-RMT, h-mtTFA y h-mtTFB1 o h-mtTFB2. Sin embargo, la naturaleza de los complejos de transcripción mitocondrial in vivo y la posible participación de proteínas adicionales en el proceso de transcripción en las mitocondrias humanas no se han investigado de forma exhaustiva. En Saccharomyces cerevisiae, la transcripción y la traducción se acoplan físicamente a través de la formación de un complejo multiproteico nucleado por la unión de Nam1p al dominio amino-terminal de la polimerasa de ARNmt (Rpo41p). Este paradigma de sistema modelo nos llevó a buscar proteínas que interactúen con POLRMT para regular la expresión génica mitocondrial en humanos. Utilizando una estrategia de captura por afinidad para identificar proteínas de unión a POL-RMT, identificamos la proteína ribosómica mitocondrial L7/L12 (MRPL12) como una proteína en extractos mitocondriales HeLa que interactúa específicamente con POLRMT in vitro. El MRPL12 recombinante purificado se une a POLRMT y estimula la actividad de transcripción mitocondrial in vitro, lo que demuestra que esta interacción es tanto directa como funcional. Finalmente, a partir de las células HeLa que sobreexpresan MRPL12 etiquetado con el epítopo FLAG, se observan niveles aumentados en estado estacionario de transcritos codificados por mtDNA y los complejos MRPL12-POLRMT pueden co-inmunoprecipitarse, proporcionando una fuerte evidencia de que esta interacción mejora la transcripción mitocondrial o la estabilidad del ARN in vivo . Especulamos que la interacción de MRPL12 con POLRMT es probablemente parte de un nuevo mecanismo regulador que coordina la transcripción mitocondrial con la traducción y/o la biogénesis del ribosoma durante la expresión del gen mitocondrial humano.

Zhang, H., Luo, Y., Zhang, W., He, Y., Dai, S., Zhang, R., Huang, Y., Bernatchez, P., Giordano, FJ, Shadel, G., Sessa, WC, Min, W. La expresión endotelial específica de tiorredoxina mitocondrial mejora la función de las células endoteliales y reduce las lesiones ateroscleróticas. (2007) Soy. J. Pathol. 170(3):1108-20. DOI: 10.2353/ajpath.2007.060960

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Lin, ZP, Belcourt, MF, Carbone, R., Eaton, JS, Penketh, PG, Sombra, GS, Cory, JG, Sartorelli, AC El exceso de subunidades R2 de ribonucleótido reductasa coordina el punto de control de la fase S para facilitar la reparación del daño del ADN y la recuperación del estrés de replicación. (2007) Biochem. Pharmacol. 73(6):760-72. DOI: 10.1016/j.bcp.2006.11.014

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La ribonucleótido reductasa (RNR), que consta de las subunidades R1 y R2, cataliza un paso clave de la síntesis de desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) para la replicación y reparación del ADN. La subunidad R2 se controla de manera específica del ciclo celular para la síntesis oportuna de ADN y está regulada negativamente por p53 en respuesta al daño del ADN. Aquí demostramos que la presencia de subunidades R2 en exceso en células de cáncer de colon humano p53(-/-) HCT-116 protege contra el daño del ADN y el estrés de replicación. La eliminación estable mediada por ARNip (>80 %) del exceso de subunidades R2 no tiene efecto sobre el crecimiento proliferativo, pero da como resultado una mayor acumulación de gamma-H2Ax y una recuperación retrasada de las lesiones del ADN infligidas por la exposición al cisplatino y la triapina. Esta inducción acentuada de gamma-H2Ax en las células R2-knockdown se atribuye a una capacidad reducida para reparar el ADN dañado y superar el bloqueo de la replicación. La falta de subunidades R2 en exceso, en consecuencia, aumenta la activación de chk1 y la degradación de cdc25A, lo que impide la progresión celular a través de la fase S y aumenta la apoptosis en respuesta al daño del ADN y al estrés de replicación. Por el contrario, el nivel de las subunidades R1 parece ser limitante, ya que el agotamiento de la subunidad R1 activa directamente el punto de control de la fase S debido al estrés de replicación asociado con la actividad RNR alterada. Estos hallazgos sugieren que el exceso de subunidades R2 facilita la reparación del daño del ADN y la recuperación del estrés de replicación a través de la coordinación con el punto de control de la fase S en ausencia de p53 funcional. Por lo tanto, el nivel de la subunidad R2 constituye un determinante importante de la quimiosensibilidad de las células cancerosas y sirve como un objetivo potencial para mejorar la terapia basada en el daño del ADN.

Cállate, TE, Sombra, GS Expansión del interactoma mitocondrial. (2007) Biología del genoma. 8(2):203. DOI: 10.1186/gb-2007-8-2-203

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2006

Bonawitz, ND, Clayton, DA, Sombra, GS Iniciación y más allá: funciones múltiples de la maquinaria de transcripción mitocondrial humana. (2006) célula molecular. 24(6):813-25. DOI: 10.1016/j.molcel.2006.11.024

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Cotney, J., Sombra, GS Evidencia de un evento temprano de duplicación de genes en la evolución de la familia del factor B de transcripción mitocondrial y el mantenimiento de la actividad de la metiltransferasa del ARNr en mtTFB1 y mtTFB2 humanos. (2006) J. Mol. Evolución. 63(5):707-17. DOI: 10.1007/s00239-006-0075-1

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La mayoría de los metazoos tienen dos genes nucleares que codifican ortólogos del bien caracterizado factor de transcripción mitocondrial B (sc-mtTFB) de Saccharomyces cerevisiae. Esta clase de factores de transcripción es homóloga a la familia KsgA bacteriana de ARNr metiltransferasas, que en Escherichia coli dimetila los residuos de adenina adyacentes en un bucle de tallo del ARNr 16S. Esta modificación postranscripcional se conserva en la mayoría de los ARNr citoplasmáticos y mitocondriales de metazoos. El factor de transcripción mitocondrial B1 del homo sapiens (h-mtTFB1) posee esta actividad enzimática, lo que implica que es una proteína de doble función involucrada en la transcripción y traducción mitocondrial. Aquí demostramos que h-mtTFB2 también tiene actividad de rRNA metiltransferasa pero es una enzima menos eficiente que h-mtTFB1. Por el contrario, sc-mtTFB no tiene actividad detectable de rRNA metiltransferasa, lo que se correlaciona con la falta de la modificación correspondiente en el rRNA mitocondrial de la levadura en ciernes. Sobre la base de estos resultados, y los informes de que Drosophila melanogaster mtTFB1 y mtTFB2 no tienen funciones completamente superpuestas, proponemos un modelo para la regulación del mtDNA humano que tiene en cuenta h-mtTFB1 y h-mtTFB2 que probablemente tengan un factor de transcripción parcialmente redundante y funciones de rRNA metiltransferasa. Finalmente, los análisis filogenéticos de esta familia de proteínas sugieren fuertemente que la presencia de dos homólogos de mtTFB en metazoos es el resultado de un evento de duplicación de genes que ocurrió temprano en la evolución eucariótica antes de la divergencia de hongos y metazoos. Este modelo sugiere que, después del evento de duplicación del gen, ocurrieron presiones selectivas diferenciales sobre las actividades de la rRNA metiltransferasa y el factor de transcripción de los genes mtTFB, con casos extremos que culminaron en la pérdida de uno de los genes parálogos en ciertas especies.

Bonawitz, ND, Rodeheffer, MS, Sombra, GS La expresión génica mitocondrial defectuosa da como resultado la inhibición de la respiración mediada por especies reactivas de oxígeno y la reducción de la vida útil de la levadura. (2006) Biología Molecular y Celular. 26(13):4818-29. DOI: 10.1128/MCB.02360-05

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2005

O'Rourke, TW, Doudican, NA, Zhang, H., Eaton, JS, Doetsch, PW, Sombra, GS Participación diferencial de las helicasas de ADN relacionadas Pif1p y Rrm3p en la mutagénesis puntual y la estabilidad del ADNmt. (2005) Gene. 354:86-92. DOI: 10.1016/j.gene.2005.03.031

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Con la excepción de la reparación por escisión de bases, las vías y mecanismos conservados que mantienen la estabilidad del genoma mitocondrial han permanecido en gran parte sin delinear. En la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, Pif1p es una ADN helicasa única que se localiza tanto en el núcleo como en las mitocondrias, donde participa en el mantenimiento de la integridad del ADN. Anteriormente aclaramos un papel para Pif1p en la resistencia al daño oxidativo del mtDNA que parece ser distinto de su función postulada en la recombinación del mtDNA. Las cepas que carecen de Pif1p (pif1Delta) exhiben una mayor tasa de formación de pequeños mutantes (un indicador de inestabilidad del mtDNA) y una elevada mutagénesis puntual del mtDNA. Aquí mostramos que la eliminación del gen RRM3, que codifica una helicasa de ADN estrechamente relacionada con Pif1p, rescata significativamente el fenotipo de inducción pequeña de una cepa pif1Delta. Sin embargo, la supresión de este fenotipo no estuvo acompañada por una disminución correspondiente en la mutagénesis puntual del mtDNA. En cambio, la eliminación de RRM3 solo resultó en un aumento en la mutagénesis puntual de mtDNA que fue sinérgica con la causada por una mutación pif1Delta. Además, encontramos que la sobreexpresión de RNR1, que codifica una subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RNR), rescató el fenotipo de inducción pequeña de una mutación pif1Delta en una medida similar a la eliminación de RRM3. Esto, junto con nuestro hallazgo de que la proteína quinasa Rad53p está fosforilada en la cepa doble mutante rrm3Delta pif1Delta, nos lleva a concluir que un mecanismo por el cual la eliminación de RRM3 influye en la estabilidad del ADNmt es mediante la modulación de los grupos de trifosfato de desoxinucleósidos mitocondriales. Proponemos que esto se logra mediante la señalización a través de la ruta de punto de control de fase S conservada Mec1/Rad53 para inducir la expresión y actividad de RNR. En conjunto, nuestros resultados definen un papel novedoso para Rrm3p en la función mitocondrial e indican que Pif1p y Rrm3p influyen en un proceso (o procesos) común involucrado en la replicación, reparación o estabilidad del mtDNA.

Sombra, GS ADN mitocondrial, la aconitasa lo 'envuelve'. (2005) Tendencias en Ciencias Bioquímicas. 30(6):294-6. DOI: 10.1016/j.tibs.2005.04.007

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Doudican, NA, Canción, B., Sombra, GS, Doetsch, PW El daño oxidativo del ADN causa inestabilidad genómica mitocondrial en Saccharomyces cerevisiae. (2005) Biología Molecular y Celular. 25(12):5196-204. DOI: 10.1128/MCB.25.12.5196-5204.2005

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Las mitocondrias contienen su propio genoma, cuya integridad es necesaria para el metabolismo energético celular normal. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) producidas por la respiración mitocondrial normal pueden dañar las macromoléculas celulares, incluido el ADN mitocondrial (ADNmt), y se han implicado en enfermedades degenerativas, cáncer y envejecimiento. Desarrollamos estrategias para elevar el estrés oxidativo mitocondrial mediante la exposición a antimicina y H(2)O(2) o utilizando mutantes que carecen de superóxido dismutasa mitocondrial (sod2Delta). Se realizaron experimentos con cepas comprometidas en la reparación de la escisión de la base mitocondrial (ntg1Delta) y la resistencia al daño oxidativo (pif1Delta) para delinear la relación entre estas vías. Observamos una mayor producción de ROS, lo que resultó en un aumento directo en el daño oxidativo y la mutagénesis del ADNmt. Los mutantes deficientes en reparación expuestos a condiciones de estrés oxidativo exhibieron una profunda inestabilidad genómica. La eliminación de Ntg1p y Pif1p resultó en una corrupción sinérgica de la competencia respiratoria tras la exposición a antimicina y H(2)O(2). La integridad genómica mitocondrial se vio sustancialmente comprometida en las cepas ntg1Delta pif1Delta sod2Delta, ya que estas células presentan una pérdida total de ADNmt. Una cepa estable con problemas de respiración, que poseía un complemento normal de las vías de resistencia al daño del ADNmt, exhibió una pérdida completa de ADNmt tras la exposición a antimicina y H(2)O(2). Esta pérdida se pudo prevenir mediante la sobreexpresión de Sod2p. Estos resultados proporcionan evidencia directa de que el daño oxidativo del mtDNA puede ser un importante contribuyente a la inestabilidad genómica mitocondrial y demuestra la cooperación de Ntg1p y Pif1p para resistir la introducción de lesiones en el genoma mitocondrial.

Taylor, SD, Zhang, H., Eaton, JS, Rodeheffer, MS, Lebedeva, MA, O'rourke, TW, Siede, W., Sombra, GS La ruta del punto de control nuclear Mec1/Rad53 conservada regula el número de copias de ADN mitocondrial en Saccharomyces cerevisiae. (2005) Biología molecular de la célula. 16(6):3010-8. DOI: 10.1091/mbc.e05-01-0053

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Se desconoce en gran medida cómo se determina y modula el número de copias del ADN mitocondrial (ADNmt) de acuerdo con las demandas celulares. Nuestras investigaciones previas de las helicasas de ADN relacionadas Pif1p y Rrm3p descubrieron un papel para estos factores y la vía del punto de control nuclear Mec1/Rad53 conservada en la mutagénesis y estabilidad del ADNmt en Saccharomyces cerevisiae. Aquí, demostramos otra función novedosa de esta vía en la regulación del número de copias de mtDNA. La eliminación de RRM3 o SML1, o la sobreexpresión de RNR1, que recapitula la activación de la vía Mec1/Rad53, resultó en un aumento de aproximadamente el doble en el contenido de mtDNA en relación con las cepas de levadura de tipo salvaje correspondientes. Además, la eliminación de RRM3 o SML1 rescató por completo el agotamiento de aproximadamente el 50 % del mtDNA observado en una cepa nula de pif1. Además, se demostró que la eliminación de SML1 es epistática tanto para una mutación nula de rad53 como para una de rrm3, colocando estos tres genes en la misma vía genética de regulación del número de copias de mtDNA. Finalmente, el aumento del número de copias de mtDNA a través de la vía Mec1/Rad53 podría ocurrir independientemente de Abf2p, una proteína de unión a mtDNA que, al igual que sus homólogos de metazoos, está implicada en el control del número de copias de mtDNA. Juntos, estos resultados indican que la señalización a través de la vía Mec1/Rad53 aumenta el número de copias de mtDNA al alterar las reservas de trifosfato de desoxirribonucleósido a través de la actividad de la ribonucleótido reductasa. Esto comprende el primer enlace de una ruta de señalización conservada para la regulación del número de copias del genoma mitocondrial y sugiere que las rutas homólogas en humanos también pueden regular el contenido de mtDNA en condiciones fisiológicas.

2004

Sombra, GS Acoplamiento de la maquinaria de transcripción mitocondrial a la enfermedad humana. (2004) Tendencias en Genética. 20(10):513-9. DOI: 10.1016/j.tig.2004.08.005

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Sombra, GS Un factor de transcripción mitocondrial de doble función elimina la sordera. (2004) Genética Molecular y Metabolismo. 82(1):1-3. DOI: 10.1016/j.ymgme.2004.02.003

2003

McCulloch, V., Sombra, GS El factor de transcripción mitocondrial humano B1 interactúa con la región de activación C-terminal de h-mtTFA y estimula la transcripción independientemente de su actividad de ARN metiltransferasa. (2003) Biología Molecular y Celular. 23 (16): 5816 24-.

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Rodeheffer, MS, Sombra, GS Múltiples interacciones que involucran el dominio amino-terminal de la polimerasa de mtRNA de levadura determinan la eficiencia de la síntesis de proteínas mitocondriales. (2003) Revista de Química Biológica. 278(20):18695-701. DOI: 10.1074/jbc.M301399200

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Seidel-Rogol, BL, McCulloch, V., Sombra, GS El factor de transcripción mitocondrial humano B1 metila el ARN ribosómico en un bucle de tallo conservado. (2003) Genética de la naturaleza. 33(1):23-4. DOI: 10.1038/ng1064

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2002

Coelho, PS, Bryan, AC, Kumar, A., Sombra, GS, Snyder, M. Una nueva proteína mitocondrial, Tar1p, está codificada en la hebra antisentido del ADNr nuclear 25S. (2002) Genes y desarrollo. 16(21):2755-60. DOI: 10.1101/gad.1035002

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O'Rourke, TW, Doudican, NA, Mackereth, MD, Doetsch, PW, Sombra, GS La disfunción mitocondrial debida al daño oxidativo del ADN mitocondrial se reduce mediante acciones cooperativas de diversas proteínas. (2002) Biología Molecular y Celular. 22 (12): 4086 93-.

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El genoma mitocondrial es un objetivo importante de agentes genotóxicos exógenos y endógenos; sin embargo, los determinantes que gobiernan esta susceptibilidad y las vías disponibles para resistir el daño del ADN mitocondrial (ADNmt) no están bien caracterizados. Aquí informamos que el daño oxidativo del mtDNA es elevado en las cepas que carecen de Ntg1p, lo que proporciona la primera evidencia funcional directa de que esta enzima de reparación por escisión de base localizada en la mitocondria funciona para proteger el mtDNA. Sin embargo, las cepas nulas de ntg1 no exhibieron un fenotipo (pequeño) de respiración mitocondrial deficiente, lo que sugiere que el daño del mtDNA es negociado por las acciones cooperativas de múltiples vías de resistencia al daño. Las mutaciones nulas en ABF2 o PIF1, dos genes implicados en el mantenimiento y la recombinación del mtDNA, exhiben un fenotipo sintético-pequeño en combinación con mutaciones nulas en ntg1 que se acompaña de una mutagénesis puntual mejorada del mtDNA en las cepas mutantes dobles correspondientes. Este fenotipo fue parcialmente rescatado por el ácido malónico, lo que indica que las especies reactivas de oxígeno generadas por la cadena de transporte de electrones contribuyen a la disfunción mitocondrial en las cepas abf2 Delta. Por el contrario, cuando se inactivaron otros dos genes implicados en la recombinación del mtDNA, CCE1 y NUC1, no se observó un fenotipo fuerte sintético-pequeño, lo que sugiere que los efectos mediados por Abf2p y Pif1p se deben a actividades novedosas de estas proteínas distintas de la recombinación. Estos resultados documentan la existencia de mecanismos independientes de recombinación además de la reparación por escisión de base para hacer frente al daño oxidativo del mtDNA en Saccharomyces cerevisiae. Dichos sistemas probablemente sean relevantes para aquellos que operan en células humanas donde la recombinación de mtDNA es menos frecuente, lo que valida a la levadura como un sistema modelo en el que estudiar estos importantes problemas.

Seidel-Rogol, BL, Sombra, GS Modulación de la transcripción mitocondrial en respuesta al agotamiento y repleción de mtDNA en células HeLa. (2002) Investigación de ácidos nucleicos. 30 (9): 1929 34-.

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McCulloch, V., Seidel-Rogol, BL, Sombra, GS Un factor de transcripción mitocondrial humano está relacionado con las RNA adenina metiltransferasas y se une a la S-adenosilmetionina. (2002) Biología Molecular y Celular. 22 (4): 1116 25-.

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Bryan, AC, Rodeheffer, EM, Wearn, CM, Sombra, GS Sls1p es un regulador unido a la membrana de los procesos acoplados a la transcripción implicados en la expresión génica mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae. (2002) Genética. 160 (1): 75 82-.

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2001

Sombra, GS, Seidel-Rogol, BL Ensayos de diagnóstico de defectos en la replicación y transcripción del mtDNA en levaduras y seres humanos. (2001) Métodos en Biología Celular. 80:465-79. DOI: 10.1016/S0091-679X(06)80023-3

Seidel-Rogol, BL, Sombra, GS Ensayos de diagnóstico de defectos en la replicación y transcripción del ADN mitocondrial en levaduras y células humanas. (2001) Métodos en Biología Celular. 65:413-27. DOI: 10.1016/s0091-679x(01)65024-6

Rodeheffer, MS, Boone, BE, Bryan, AC, Sombra, GS Nam1p, una proteína implicada en el procesamiento y la traducción del ARN, se acopla a la transcripción a través de una interacción con la ARN polimerasa mitocondrial de levadura. (2001) Revista de Química Biológica. 276(11):8616-22. DOI: 10.1074/jbc.M009901200

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2000

Devine, JH, Sombra, GS Ensayo de actividad autoinductora con cepas sensoras de Escherichia coli luminiscentes que albergan un regulón de Vibrio fischeri lux modificado. (2000) metanfetamina Enzimol. 305:279-87. DOI: 10.1016/s0076-6879(00)05494-x

Sombra, GS, Buckenmeyer, GA, Clayton, DA, Schmitt, ME El análisis mutacional del componente de ARN de Saccharomyces cerevisiae RNase MRP revela distintos fenotipos nucleares. (2000) Gene. 245(1):175-84. DOI: 10.1016/s0378-1119(00)00013-5

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1999

Sombra, GS La levadura como modelo para la replicación del mtDNA humano. (1999) Revista americana de genética humana. 65 (5): 1230-7. DOI: 10.1086/302630

Wang, Y., Sombra, GS La estabilidad del genoma mitocondrial requiere un dominio amino-terminal de ARN polimerasa mitocondrial de levadura. (1999) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 96(14):8046-51. DOI: 10.1073/pnas.96.14.8046

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1997

Sombra, GS, Clayton, DA Mantenimiento del ADN mitocondrial en vertebrados. (1997) Revisión anual de bioquímica. 66:409-35. DOI: 10.1146/annurev.biochem.66.1.409

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1996

Sítnikov, DM, Sombra, GS, Balduino, TO Los mutantes independientes del autoinductor del activador transcripcional LuxR exhiben efectos diferenciales en los dos promotores lux de Vibrio fischeri. (1996) Genética Molecular y General. 252(5):622-5. DOI: 10.1007/bf02172408

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La proteína LuxR es un activador transcripcional que, junto con una pequeña molécula difusible denominada autoinductor [N-(3-oxohexanoil)-L-homo-serina lactona], representa el nivel principal de regulación de los genes de bioluminiscencia en Vibrio fischeri. LuxR, en presencia de un autoinductor, activa la transcripción del grupo de genes luxICDABEG y autorregula positiva y negativamente la transcripción del gen luxR de orientación divergente, activando la transcripción a niveles bajos de autoinductor y reprimiendo la síntesis a una concentración alta de autoinductor. Se han caracterizado siete mutantes puntuales de LuxR que activan la transcripción de V. fischeri lux en ausencia de autoinductor (LuxR*). Las proteínas LuxR* activaron la transcripción de los genes de bioluminiscencia a niveles de 1.5 a 40 veces superiores a los logrados por LuxR de tipo salvaje sin autoinductor. Todos los mutantes LuxR* conservaron la capacidad de respuesta al autoinductor. Sin embargo, en cada caso el grado de estimulación en respuesta al autoinductor fue menor que el observado para LuxR de tipo salvaje. Las proteínas LuxR* conservaron el requisito de autoinductor para la autorregulación del gen luxR. Proponemos que la proteína LuxR existe en dos conformaciones, una forma inactiva y una forma activa que predomina en presencia de autoinductor. Las mutaciones LuxR* parecen cambiar la distribución de equilibrio de estas dos formas para aumentar la cantidad de la forma activa en ausencia del autoinductor, mientras que el autoinductor aún puede convertir especies inactivas en activas. Los efectos diferenciales de las proteínas LuxR* en los dos promotores lux sugieren que LuxR estimula la transcripción de PluxR mediante un mecanismo diferente al utilizado en el promotor PluxI, lo que implica que la unión de LuxR a su sitio de unión, que se sabe que es necesaria para la activación transcripcional, puede no ser suficiente.

Sombra, GS, Clayton, DA Aislamiento y caracterización de homólogos del factor A de transcripción mitocondrial de vertebrados. (1996) metanfetamina Enzimol. 264:149-58. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64016-6

Sombra, GS, Clayton, DA Mapeo de promotores en la región del bucle de desplazamiento del ADN mitocondrial de vertebrados. (1996) metanfetamina Enzimol. 264:139-48. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64015-4

Carrodeguas, JA, Yun, S., Sombra, GS, Clayton, DA, Bogenhagen, DF Conservación funcional de mtTFB de levadura a pesar de la amplia divergencia de secuencias. (1996) Expr. gen. 6 (4): 219 30-.

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1995

Dairaghi, DJ, Sombra, GS, Clayton, DA El factor A de transcripción mitocondrial humano y la integridad del espaciado del promotor son necesarios para el inicio de la transcripción. (1995) Biochimica et Biophysica Acta. 1271(1):127-34. DOI: 10.1016/0925-4439(95)00019-z

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Dairaghi, DJ, Sombra, GS, Clayton, DA La adición de una cola carboxilo terminal de 29 residuos convierte una proteína simple que contiene la caja HMG en un activador transcripcional. (1995) Revista de Biología Molecular. 249(1):11-28. DOI: 10.1006/jmbi.1995.9889

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Sombra, GS, Clayton, DA Un factor de transcripción mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae, sc-mtTFB, comparte características con los factores sigma pero es funcionalmente distinto. (1995) Biología Molecular y Celular. 15(4):2101-8. DOI: 10.1128/mcb.15.4.2101

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1993

Sombra, GS, Clayton, DA Iniciación de la transcripción mitocondrial. Variación y conservación. (1993) Revista de Química Biológica. 268 (22): 16083 6-.

1992

Sombra, GS, Balduino, TO Autorregulación positiva del gen luxR de Vibrio fischeri. LuxR y el autoinductor activan la transcripción de luxR independiente y dependiente del complejo de proteína activadora del gen cAMP-catabolito. (1992) Revista de Química Biológica. 267 (11): 7696 702-.

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La proteína LuxR es un activador transcripcional implicado en la regulación de los genes necesarios para la bioluminiscencia (lux) en la bacteria marina Vibrio fischeri. LuxR activa la transcripción de los dos operones lux orientados divergentemente (luxR y luxICDABEG) en presencia de un inductor difusible (autoinductor). La transcripción del gen luxR está sujeta a autorregulación tanto positiva como negativa, así como a la activación por el complejo de proteína activadora del gen cAMP-catabolito (cAMP-CAP). La transcripción de luxR se estudió usando luminiscencia in vivo como informador y análisis de extensión de cebadores del ARNm sintetizado in vivo. La mutación del sitio de unión a lux CAP resultó en una reducción de la luminiscencia del reportero y la pérdida completa de la autorregulación positiva de luxR. Se restauró la autorregulación positiva si se proporcionó luxR en trans, lo que demuestra que LuxR y el autoinductor activan la transcripción de luxR en ausencia de cAMP-CAP. Por medio del análisis de extensión de cebadores, se demostraron tres sitios de iniciación de la transcripción de luxR; la iniciación en dos de estos sitios requirió cAMP-CAP. La cantidad de las tres transcripciones aumentó en presencia de LuxR y autoinductor cuando se usó un plásmido con un sitio de unión a CAP de tipo salvaje. No se observó iniciación en los sitios dependientes de cAMP-CAP a partir de un plásmido con un sitio de unión a CAP mutado en presencia o ausencia de autoinductor incluso con luxR suministrado en trans. En cambio, con luxR suministrado en trans, la iniciación en el sitio de iniciación independiente de cAMP-CAP fue estimulada específicamente por LuxR y el autoinductor. Así, en el curso de la autorregulación positiva, la proteína LuxR activa la transcripción de dos promotores luxR por un mecanismo dependiente de cAMP-CAP y un tercer promotor por un mecanismo independiente de cAMP-CAP.

Sombra, GS, Balduino, TO Identificación de un elemento regulador ubicado a distancia en el gen luxD requerido para la autorregulación negativa del gen luxR de Vibrio fischeri. (1992) Revista de Química Biológica. 267 (11): 7690 5-.

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La expresión de bioluminiscencia en la bacteria marina Vibrio fischeri está controlada por un mecanismo regulador único dependiente de la densidad celular denominado autoinducción. Los genes necesarios para la bioluminiscencia (los genes lux) están organizados en dos operones transcritos de forma divergente (luxR-luxICDABEG). Un operón (luxICDABEG) contiene los genes necesarios para la producción de luz (luxCDABE) y la síntesis de una molécula de señal difusible llamada autoinductor (luxI). El otro operón contiene el gen luxR que codifica una proteína reguladora de la transcripción que activa la transcripción de ambos operones lux en presencia de un autoinductor. Este mecanismo de estimulación bidireccional conduce a un circuito de retroalimentación positiva que da como resultado un rápido aumento en la producción de luz a una densidad de células de cultivo particular que es característica de la autoinducción. La retroalimentación positiva transcripcional aparentemente está limitada por un circuito autorregulador negativo a través del cual LuxR actúa para inhibir su propia síntesis. La autorregulación transcripcional negativa requiere un autoinductor, el operador lux ubicado en la región de control (que es el sitio de unión para LuxR) y secuencias de ADN de acción negativa en el operón luxICDABEG. El análisis de eliminación del operón luxICDABEG demostró que un elemento de acción negativa está ubicado en el gen luxD en una posición a 2.0 kilobases del operador lux. La secuencia de nucleótidos de este elemento luxD es similar al operador lux (11 de 20 pares de bases idénticos) y puede funcionar como un sitio de unión a LuxR cuando reemplaza al operador lux en la región de control. Estos resultados sugieren que el elemento luxD funciona como un sitio de unión de baja afinidad para LuxR y que se requiere la ocupación de este sitio para lograr la autorregulación transcripcional negativa de luxR.

1991

Sombra, GS, Balduino, TO La proteína LuxR de Vibrio fischeri es capaz de estimulación bidireccional de la transcripción y regulación tanto positiva como negativa del gen luxR. (1991) J. Bacteriol. 173(2):568-74. DOI: 10.1128/jb.173.2.568-574.1991

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La regulación de los genes necesarios para la bioluminiscencia en la bacteria marina Vibrio fischeri (el lux regulon) es un proceso complejo que requiere la coordinación de varios sistemas. El nivel primario de regulación está mediado por una proteína reguladora positiva, LuxR, y una pequeña molécula difusible, N-(3-oxo-hexanoil)-homoserina lactona, denominada autoinductor. La transcripción del gen luxR, que codifica la proteína reguladora, está regulada positivamente por el sistema cíclico AMP-CAP. El regulón lux de V. fischeri consta de dos operones transcritos de forma divergente denominados operonL y operonR. LuxR activa la transcripción del operón hacia la derecha (operonR; luxICDABE), que consta de los genes necesarios para la síntesis del autoinductor (luxI) y la producción de luz (luxCDABE), de forma dependiente del autoinductor. El operón hacia la izquierda (operonL) consta de un solo gen conocido, luxR. También se ha demostrado que la proteína LuxR disminuye la transcripción del operón L a través de un mecanismo dependiente de autoinductor, regulando así negativamente su propia síntesis. En este artículo, demostramos que la represión dependiente del autoinductor de la transcripción del operón L requiere no solo LuxR sino también secuencias de ADN dentro del operón R que se encuentran aguas arriba del promotor del operón L. En ausencia de estas secuencias de ADN, la proteína LuxR provoca una activación de la transcripción del operón L dependiente del autoinductor. Se requería el operador lux, ubicado en la región de control entre los dos operones, para las respuestas dependientes del autoinductor tanto positivas como negativas. Mediante la titulación de niveles altos de LuxR suministrados en trans con autoinductor sintético, descubrimos que los niveles bajos de autoinductor podrían provocar una respuesta positiva incluso en presencia de secuencias de ADN de acción negativa, mientras que los niveles más altos de autoinductor dieron como resultado una respuesta negativa. Sin estas secuencias de ADN en el operonR, LuxR y el autoinductor estimularon la transcripción independientemente del nivel de autoinductor. Estos resultados sugieren que un cambio entre la estimulación y la represión de la transcripción del operón L está mediado por los niveles del complejo LuxR-autoinductor, que en estos experimentos refleja el nivel de autoinductor en el medio de cultivo.

1990

Sombra, GS, Young, R., Baldwin, TO Uso de lisis celular regulada en una selección genética letal en Escherichia coli: identificación de la región de unión al autoinductor de la proteína LuxR de Vibrio fischeri ATCC 7744. (1990) J. Bacteriol. 172(7):3980-7. DOI: 10.1128/jb.172.7.3980-3987.1990

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Sombra, GS, Devine, JH, Baldwin, TO Control del regulón lux de Vibrio fischeri. (1990) J. Biolumin. Quimioluminia. 5(2):99-106. DOI: 10.1002/bio.1170050205

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1989

Devine, JH, Sombra, GS, Balduino, TO Identificación del operador del regulón lux de la cepa Vibrio fischeri ATCC7744. (1989) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 86(15):5688-92. DOI: 10.1073/pnas.86.15.5688

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Escherichia coli que lleva un plásmido recombinante que lleva el regulón Vibrio fischeri lux expresa luminiscencia que imita la luminiscencia de V. fischeri. El regulón lux consta de dos operones transcritos de forma divergente, el operón hacia la derecha (genes luxICDABE) y el operón hacia la izquierda (gen luxR). Los genes luxR y luxI y la región de control que separa los dos operones proporcionan el control regulador primario sobre el regulón lux; los mecanismos reguladores dan como resultado un aumento dramático en la tasa de síntesis de luciferasa después de la inducción, aparentemente debido a un mecanismo único de retroalimentación positiva autorregulador, y en una enorme diferencia (superior a 10(4) en los niveles de luminiscencia en las células antes y después de la inducción. El modelo generalmente aceptado de regulación primaria de la bioluminiscencia en V. fischeri implica la interacción del producto del gen luxR y la N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona, el autoinductor producido por la enzima codificada por luxI, el primer gen del gen hacia la derecha. operón, con una secuencia de operador dentro de la región de control para estimular la transcripción del operón hacia la derecha en un circuito de retroalimentación positiva. Hemos utilizado el mapeo de eliminación de un vector informador de transcripción para determinar la ubicación aproximada del operador. Por mutagénesis dirigida al sitio del presunto operador, hemos demostrado que la repetición invertida de 20 pares de bases ACCTGTAGGA/TCGTA CAGGT (donde la línea vertical es el centro de simetría), que tiene una sorprendente similitud con la secuencia de reconocimiento de la proteína represora pleiotrópica LexA, es el operador de la regulón de lux. También encontramos que la eliminación de secuencias aguas arriba del palíndromo conduce a una mayor transcripción del promotor hacia la derecha (PR), indicativo de un elemento que actúa en cis que reprime la transcripción en ausencia del complejo LuxR-autoinductor. Las modificaciones del palíndromo que eliminan la estimulación por el autoinductor LuxR de la transcripción de PR no tienen efecto sobre la represión por los mecanismos que actúan en cis, lo que sugiere que el palíndromo no es necesario para la represión del operón hacia la derecha. Por tanto, parece que el gran aumento de la transcripción tras la inducción del regulón lux es el resultado de al menos dos mecanismos independientes, uno positivo y otro negativo.

Baldwin TO Devine JH Heckel RC Lin JW Sombra, GS La secuencia completa de nucleótidos del regulón lux de Vibrio fischeri y la región luxABN de Photobacterium leiognathi y el mecanismo de control de la bioluminiscencia bacteriana. (1989) J. Biolumin. Quimioluminia. 4(1):326-41. DOI: 10.1002/bio.1170040145

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Hemos determinado la secuencia de nucleótidos completa de un fragmento de ADN de 7622 pares de bases de la cepa ATCC7744 de Vibrio fischeri que contiene toda la información necesaria para conferir bioluminiscencia regulada transmitida por plásmidos a cepas de Escherichia coli. El regulón lux de V. fischeri consta de dos operones transcritos de forma divergente, L (izquierda) y R (derecha), y al menos siete genes, luxR (operón L) y luxICDABE (operón R) y la región de control intermedia. Los genes luxA y luxB codifican respectivamente las subunidades alfa y beta de la luciferasa. El orden de genes luxCDABE observado en V. fischeri es el mismo que para V. harveyi. Hemos determinado la secuencia de luxAB y las regiones flanqueantes de Photobacterium leiognathi y hemos encontrado secuencias aguas arriba homólogas con luxC de la especie Vibrio, pero entre luxB y luxE hay un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 227 aminoácidos (peso molecular 26,229). ) que no se encuentra en esta localidad en la especie Vibrio. La secuencia de aminoácidos amino terminal de la proteína codificada es casi idéntica a la determinada por O'Kane y Lee (Universidad de Georgia) para la flavoproteína no fluorescente de una especie de Photobacterium estrechamente relacionada (Dr. Dennis O'Kane, comunicación personal). Por lo tanto, hemos designado este gen como luxN. Hay una repetición invertida de 20 bases ACCTGTAGGAxTCGTACAGGT, centrada entre las bases 927 y 928 en la región entre los dos operones de V. fischeri. Esta región parece cumplir dos funciones: es crítica para que la proteína LuxR ejerza su efecto y es un sitio de unión consenso para la proteína LexA de E. coli, una proteína reguladora negativa involucrada en la respuesta SOS. Hay secuencias dentro de la región codificante de luxR que parecen funcionar de manera que actúan en cis para reprimir la transcripción de los promotores hacia la izquierda y hacia la derecha en ausencia de las respectivas proteínas activadoras de la transcripción, lo que da como resultado niveles basales bajos de transcripción. Ahora parece claro que existen múltiples niveles de control en el sistema lux que permiten una modulación de la intensidad de la bioluminiscencia de más de cuatro órdenes de magnitud.

Dr. Gerald Shadel

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