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Biswas, A., Choudhuri, I., Arnold, E., Lyumkis, D., Haldane, A., Levy, RM Los modelos cinéticos coevolutivos predicen la aparición temporal de mutaciones de resistencia al VIH-1 bajo presión de selección de fármacos. (2024) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 121(15):e2316662121. DOI: 10.1073/pnas.2316662121

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La resistencia a los medicamentos en el VIH tipo 1 (VIH-1) es un problema generalizado que afecta las vidas de millones de personas en todo el mundo. Aunque los registros de mutaciones resistentes a los medicamentos (DRM) se han tabulado ampliamente en repositorios públicos, nuestra comprensión de la cinética evolutiva de las DRM y cómo evolucionan juntas sigue siendo limitada. La epistasis, la interacción entre un DRM y otros residuos en las secuencias de proteínas del VIH-1, es clave para la evolución temporal de la resistencia a los medicamentos. Utilizamos un modelo estadístico-energético de covariación de secuencia de Potts de la aptitud de la proteína VIH-1 bajo presión de selección de fármacos, que captura interacciones epistáticas entre todas las posiciones, combinado con simulaciones cinéticas de Monte-Carlo de trayectorias evolutivas de secuencia, para explorar la adquisición de DRM a medida que surgen en un conjunto de secuencias de proteínas de pacientes sin tratamiento previo. Seguimos el curso temporal de 52 DRM en las enzimas proteasa, RT e integrasa, los objetivos principales de la terapia antirretroviral. Las tasas a las que surgen los DRM están altamente correlacionadas con las tasas de adquisición observadas reportadas en la literatura cuando se aplica presión farmacológica. Este resultado resalta el papel central de la epistasis en la determinación de la cinética que rige la aparición de DRM. Mientras que los DRM adquiridos rápidamente comienzan a acumularse tan pronto como se aplica la presión del fármaco, los DRM adquiridos lentamente dependen de mutaciones accesorias que aparecen sólo después de una presión prolongada del fármaco. Proporcionamos una base para el uso de métodos computacionales para determinar la evolución temporal de la resistencia a los medicamentos utilizando los potenciales estadísticos de Potts, que pueden usarse para obtener conocimientos mecanicistas sobre las vías de resistencia a los medicamentos en el VIH-1 y otros agentes infecciosos.

Van Veen, D., Galaz-Montoya, JG, Shen, L., Baldwin, P., Chaudhari, AS, Lyumkis, D., Schmid, MF, Chiu, W., Pauly Finalización de cuñas faltantes mediante aprendizaje no supervisado con redes de coordenadas [Preimpresión] (2024) bioRxiv. DOI: doi: https://doi.org/10.1101/2024.04.12.589090

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Dong, X., Sheng, K., Gebert, LFR, Aiyer, S., MacRae, IJ, Lyumkis, D. Ensamblaje del ribosoma bacteriano con ARNr permutado circularmente (2024) bioRxiv. DOI: https://doi.org/10.1101/2024.04.10.588894

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Aiyer, S., Baldwin, PR, Tan, SM, Shan, Z., Oh, J., Mehrani, A., Bowman, ME, Louie, G., Passos, DO, Đorđević-Marquardt, S., Mietzsch, M., Hull, JA, Hoshika, S., Barad, BA, Grotjahn, DA, McKenna, R., Agbandje-McKenna, M., Benner, SA, Noel, JAP, Wang, D., Tan, YZ, Lyumkis, D. Superar la atenuación de la resolución durante la recopilación de datos crio-EM inclinados. (2024) Nature Communications. 15(1):389. DOI: 10.1038/s41467-023-44555-7

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Sun, Q., Biswas, A., Lyumkis, D., Levy, R., Deng, N. Aclaración de los determinantes moleculares de los modos de unión de un inhibidor de transferencia de cadena de la integrasa del VIH-1 de tercera generación: la importancia de la cadena lateral y la reorganización del disolvente. (2024) Virus 16(1). DOI: 10.3390/v16010076

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Los inhibidores de la transferencia de hebras (INSTI) de la integrasa (IN) del VIH-1 de primera y segunda generación utilizados clínicamente son componentes clave de la terapia antirretroviral (TAR), que funcionan bloqueando el paso de integración en el ciclo de replicación del VIH-1 que es catalizado por un conjunto de nucleoproteínas llamado intasoma. Sin embargo, está empezando a surgir resistencia incluso a los INSTI más recientes de uso clínico. Los INSTI en desarrollo de tercera generación, basados en estructuras de naftiridina, son candidatos prometedores para combatir variantes virales resistentes a los medicamentos. Entre estos nuevos INSTI, el compuesto exhibe dos conformaciones distintas cuando se une a los intasomas del VIH-1 y al prototipo de virus espumoso (PFV), estrechamente relacionado, a pesar de la alta similitud estructural de sus bolsas de unión a INSTI. El mecanismo molecular y los residuos clave del sitio activo responsables de estos diferentes modos de unión en intasomas estrechamente relacionados siguen siendo difíciles de alcanzar. Para desentrañar los determinantes moleculares que gobiernan los dos modos de unión distintos, aplicamos un nuevo método de energía libre basado en la dinámica molecular que utiliza vías alquímicas para superar los desafíos de muestreo asociados con la transición entre las dos conformaciones ligadas del ligando dentro de los entornos abarrotados de la unión INSTI. bolsillos en estos intasomas. Las energías libres conformacionales calculadas recapitulan con éxito las preferencias del modo de unión observadas experimentalmente en los dos intasomas virales. El análisis de las estructuras simuladas sugiere que las preferencias del modo de unión observadas son causadas por diferencias de residuos de aminoácidos en el subbolsillo catalítico frontal y central del sitio de unión INSTI en VIH-1 y PFV. Cálculos adicionales de energía libre en mutantes de VIH-1 y PFV revelaron que, si bien ambos subbolsillos contribuyen a la selección del modo de unión, el subbolsillo central desempeña un papel más importante. Estos resultados resaltan la importancia de la reorganización de la cadena lateral y del disolvente, así como de la entropía conformacional para determinar el modo de unión del ligando, y ayudarán a informar el desarrollo de INSTI más eficaces para combatir variantes virales resistentes a los medicamentos.

Jing, T., Shan, Z., Dinh, T., Biswas, A., Jang, S., Greenwood, J., Li, M., Zhang, Z., Gray, G., Shin, HJ, Zhou , B., Passos, D., Aiyer, S., Li, Z., Craigie, R., Engelman, AN, Kvaratskhelia, M., Lyumkis, D. Las estructuras oligoméricas de la integrasa del VIH-1 revelan plasticidad funcional para el ensamblaje del intasoma y la unión al ARN. (2024) bioRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.01.26.577436

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Haack, DB, Rudolfs, B., Zhang, C., Lyumkis, D., Toor, N. Base estructural de la ramificación durante el empalme de ARN. (2023) Naturaleza Biología Estructural y Molecular. DOI: 10.1038/s41594-023-01150-0

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Oh, J., Shan, Z., Hoshika, S., Xu, J., Chong, J., Benner, SA, Lyumkis, D., Wang, D. Una geometría unificada de Watson-Crick impulsa la transcripción de alfabetos de ADN expandidos de seis letras mediante la ARN polimerasa de E. coli. (2023) Nature Communications. 14(1):8219. DOI: 10.1038/s41467-023-43735-9

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Xie, L., Bowman, ME, Louie, GV, Zhang, C., Ardejani, MS, Huang, X., Chu, Q., Donaldson, CJ, Vaughan, JM, Shan, H., Powers, ET, Kelly , JW, Lyumkis, D., Noel, JP, Saghatelian, A. Bioquímica e interacciones proteicas de la microproteína CYREN. (2023) Bioquímica. DOI: 10.1021 / acs.biochem.3c00397

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Sheng, K., Li, N., Rabuck-Gibbons, JN, Dong, X., Lyumkis, D., Williamson, JR Paisaje de ensamblaje de la subunidad ribosómica grande bacteriana. (2023) Nature Communications. 14(1):5220. DOI: 10.1038/s41467-023-40859-w

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Li, M., Oliveira Passos, D., Shan, Z., Smith, SJ, Sun, Q., Biswas, A., Choudhuri, I., Strutzenberg, TS, Haldane, A., Deng, N., Li, Z., Zhao, XZ, Briganti, L., Kvaratskhelia, M., Burke, TR, Levy, RM, Hughes, SH, Craigie, R., Lyumkis, D. Mecanismos de resistencia de la integrasa del VIH-1 a dolutegravir y potente inhibición de variantes resistentes a los medicamentos. (2023) Avances de la ciencia. 9(29):eadg5953. DOI: 10.1126/sciadv.adg5953

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Dong, X., Doerfel, LK, Sheng, K., Rabuck-Gibbons, JN, Popova, AM, Lyumkis, D., Williamson, JR El montaje in vitro casi fisiológico de los ribosomas 50S implica vías paralelas. (2023) Investigación de ácidos nucleicos. DOI: 10.1093/nar/gkad082

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Lyumkis, D., Horton, Carolina del Norte El papel de la filamentación en la activación y la especificidad de secuencia de ADN de la endonucleasa específica de secuencia SgrAI. (2022) Transacciones de la Sociedad Bioquímica. DOI: 10.1042/BST20220547

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La formación de filamentos por enzimas metabólicas, biosintéticas y de otro tipo se ha enfocado recientemente como un mecanismo para ajustar la actividad enzimática en la célula. La filamentación es clave para la función de SgrAI, una endonucleasa de ADN específica de secuencia que ha servido como sistema modelo para proporcionar algunos de los conocimientos más profundos sobre las características biofísicas de la filamentación y sus consecuencias funcionales. Los análisis de estructura y función revelan que, en el estado filamentoso, SgrAI estabiliza una conformación enzimática activada que conduce a una actividad acelerada de escisión del ADN y una especificidad de secuencia de ADN ampliada. Se cree que este último está mediado por la estructura de ADN específica de la secuencia, las interacciones proteína-ADN y una transición de desorden a orden en la proteína, que colectivamente afectan las estabilidades relativas de la conformación no filamentosa inactiva y la filamentosa activa. conformación de SgrAI unido al ADN. El modelado cinético global completo de la ruta de escisión del ADN revela una constante de asociación de segundo orden lenta y limitante de la velocidad para el ensamblaje de filamentos, y las simulaciones de la actividad in vivo predicen que la filamentación es superior a los mecanismos no filamentosos para garantizar una activación y secuestro rápidos de Actividad de escisión del ADN de SgrAI en el ADN del fago y lejos del cromosoma huésped. Los estudios in vivo demuestran el requisito crítico para la escisión acelerada del ADN por SgrAI en su función biológica para proteger al huésped bacteriano. En conjunto, estos datos han mejorado nuestra comprensión de cómo la filamentación puede regular la estructura y la función de la enzima, mientras que las estrategias experimentales utilizadas para SgrAI se pueden aplicar a otros sistemas enzimáticos para identificar nuevos roles funcionales para la filamentación.

Sheng, K., Li, N., Rabuck-Gibbons, JN, Ding, X., Lyumkis, D., Williamson, JR La segmentación basada en Voxel no supervisada revela un paisaje de ensamblaje temprano de la subunidad grande del ribosoma bacteriano (2022) bioRiv. DOI: https://doi.org/10.1101/2022.11.09.515851

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La biogénesis de ribosomas es un proceso complejo pero eficiente en bacterias de rápido crecimiento, donde ensamblar un ribosoma 70S funcional toma ~ 2 min, involucrando la participación de 3 rRNA, 50 r-proteínas y docenas de factores de ensamblaje. La reconstitución in vitro utilizando diferentes subconjuntos de proteínas de subunidad grande (50S, LSU) con ARNr, iniciada por el laboratorio de Nierhaus, dio como resultado el mapa de ensamblaje de Nierhaus, que incorpora la cooperatividad y la dependencia para la unión de las proteínas LSU r al ARNr 23S. Críticamente ausente del mapa de Nierhaus está el plegamiento subyacente del ARNr que crea los sitios de unión para las proteínas r. Además, queda por determinar la relación de la cooperatividad observada in vitro con el ensamblaje cotranscripcional en las células. Los intermedios anteriores a 50S se acumulan a baja temperatura en ΔdeaD, una helicasa de caja muerta implicada en el ensamblaje de 50S. Resolvimos 21 mapas de densidad anteriores a 50S a partir de fracciones de contenido intermedio utilizando crio-EM. En los mapas recién resueltos, descubrimos el primer intermedio jamás informado, que consiste en el dominio I en el extremo 5' del ARNr 23S. Para probar el mecanismo detrás de los mapas durante el ensamblaje, desarrollamos un nuevo método de análisis de dependencia y segmentación de mapas de densidad. Se identificaron diez bloques de ensamblaje cooperativo a partir de la segmentación de los mapas, y estos se organizaron en un mapa de dependencia de bloques. Esta es la primera vez que las dependencias del plegamiento de las hélices de ARNr y la unión a proteínas ribosómicas pueden integrarse en un mapa de ensamblaje completo. Además, mostramos cómo el túnel de salida se pliega en el lado del solvente, sirviendo como andamio para la maduración 50S. Usando este nuevo método de análisis de segmentación, revisamos los conjuntos de datos de agotamiento de bL17 y ΔsrmB informados anteriormente. Lo más notable es que los otros dos conjuntos de datos también son consistentes con la dependencia del bloque, lo que implica una vía de ensamblaje temprano unificada y un paisaje de maduración flexible a principios de la biogénesis de 50S.

Jóźwik, IK, Li, W., Zhang, DW, Wong, D., Grawenhoff, J., Ballandras-Colas, A., Aiyer, S., Cherepanov, P., Engelman, AN, Lyumkis, D. Transición de B a A en el ADN diana durante la integración retroviral. (2022) Investigación de ácidos nucleicos. DOI: 10.1093/nar/gkac644

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Harrison, JJEK, Oliveira Passos, D., Bruhn, JF, Bauman, JD, Tuberty, L., DeStefano, JJ, Xavier Ruiz, F., Lyumkis, D., Arnold, E. La estructura Cryo-EM de la poliproteína Pol del VIH-1 proporciona información sobre la maduración del virión (2022) Avances de la ciencia. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.abn9874

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Aiyer, S., Strutzenberg, TS, Bowman, ME, Noel, JP, Lyumkis, D. Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de escenario usando Leginon. (2022) Júpiter.(185) DOI: 10.3791/64136

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Ballandras-Colas, A., Chivukula, V., Gruszka, DT, Shan, Z., Singh, PK, Pye, VE, McLean, RK, Bedwell, GJ, Li, W., Nans, A., Cook, NJ , Fadel, HJ, Poeschla, EM, Griffiths, DJ, Vargas, J., Taylor, IA, Lyumkis, D., Yardimci, H., Engelman, AN, Cherepanov, P. Interacciones multivalentes esenciales para la función de la integrasa lentiviral. (2022) Nature Communications. 13(1):2416. DOI: 10.1038/s41467-022-29928-8

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Horton, N., Ghadirian, N., Shan, Z., Lyumkis, D. Mecanismo de Activación de SgrAI vía Filamentación Enzimática y Mecanismo de Expansión de Especificidad de Secuencia de ADN. (2022) Revista FASEB. 36 Suplemento 1:ESTO ES SÓLO UN RESUMEN. DOI: 10.1096/fasebj.2022.36.S1.0R839

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Describimos una nueva estructura CryoEM de 2.7 Å de una enzima formadora de filamentos, SgrAI, en un estado previo a la transición capturado justo antes del ataque nucleófilo. Las enzimas formadoras de filamentos son enzimas que forman estructuras lineales, helicoidales e incluso tubulares que pueden actuar para regular la actividad enzimática, desempeñar un papel en la señalización, compartimentos celulares sin membrana separados en fase nucleada u otras posibles funciones. SgrAI es una endonucleasa de ADN específica de secuencia que desempeña un papel en la inmunidad innata bacteriana. La carrera armamentista fago-huésped es posiblemente el sistema coevolutivo más antiguo en el que las bacterias desarrollan sistemas para defenderse contra el ADN invasor, y los fagos desarrollan sistemas para burlar las defensas bacterianas. SgrAI forma filamentos con una simetría helicoidal levógira de cuatro copias por vuelta, que en principio podrían extenderse indefinidamente. La cinética de asociación y disociación del filamento y las concentraciones de SgrAI unido al ADN limitan el tamaño del filamento en condiciones de laboratorio a 2-20 copias de la enzima, y el número de sitios de reconocimiento en el genoma de un fago limita el tamaño del filamento in vivo. La filamentación activa la constante de velocidad de SgrAI para la escisión del ADN de 200 a 1000 veces, y también expande la especificidad de la secuencia de ADN de SgrAI para incluir catorce secuencias de reconocimiento adicionales. Nuestro trabajo anterior ha mostrado los detalles de la arquitectura filamentosa, los cambios conformacionales en el ADN y la proteína unidos, así como la ruta cinética enzimática completa, incluidas las constantes de velocidad microscópicas para cada paso. Estos estudios sugieren que el mecanismo regulador inusual que involucra la filamentación evolucionó en SgrAI para maximizar su actividad anti-fago mientras protege el genoma inusualmente largo de su huésped de las roturas de ADN dañinas. Nuestra nueva estructura conecta el cambio conformacional observado en SgrAI en forma filamentosa con la unión de un segundo catión divalente en el sitio activo, lo que da como resultado la tasa de escisión del ADN activado observada. En combinación con una estructura cristalina de rayos X recientemente informada de apo SgrAI, proponemos mecanismos para la expansión de la especificidad de la secuencia de ADN tras la filamentación que implica una transición de desorden a orden, la energía de la estructura del ADN y las interacciones proteína-ADN.

Rabuck-Gibbons, JN, Lyumkis, D., Williamson, JR Minería cuantitativa de heterogeneidad composicional en conjuntos de datos crio-EM de intermedios de ensamblaje de ribosomas. (2022) Estructura. DOI: 10.1016/j.str.2021.12.005

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Shan, Z., Ghadirian, N., Lyumkis, D., Horton, Carolina del Norte El estado previo a la transición y las estructuras apo de la enzima formadora de filamentos SgrAI dilucidan los mecanismos de activación y la especificidad del sustrato. (2022) Revista de Química Biológica.:101760 DOI: 10.1016/j.jbc.2022.101760

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Passos, DO, Li, M., Craigie, R., Lyumkis, D. Capítulo de libro - Integrasa retroviral: estructura, mecanismo e inhibición (2021) Las Enzimas. 50:249-300. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.enz.2021.06.007

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Lyumkis, D. Capítulo de libro: Orientación preferente. Cómo reconocer y tratar los efectos adversos. (2021) Cryo-EM de una sola partícula de macromoléculas biológicas. DOI: 10.1088/978-0-7503-3039-8

Smith, SJ, Zhao, XZ, Passos, DO, Pye, VE, Cherepanov, P., Lyumkis, D., Burke, TR, Hughes, SH Inhibidores de la integrasa del VIH-1 con modificaciones que afectan sus potencias contra mutantes de la integrasa resistentes a fármacos. (2021) Enfermedad infecciosa por SCA. DOI: 10.1021/acsinfecdis.0c00819

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Smith, SJ, Zhao, XZ, Passos, DO, Lyumkis, D., Burke, TR, Hughes, SH Los inhibidores de la transferencia de la cadena de integrasa son fármacos eficaces contra el VIH. (2021) Virus 13(2). DOI: 10.3390/v13020205

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Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, PR, Lyumkis, D. Evaluación de la resolución local y direccional de los mapas de densidad Cryo-EM. (2020) Métodos en Biología Molecular. 2215:161-187. DOI: 10.1007/978-1-0716-0966-8_8

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Jóźwik, IK, Passos, DO, Lyumkis, D. Biología estructural de los inhibidores de la transferencia de cadenas de la integrasa del VIH. (2020) Tendencias en Ciencias Farmacológicas. DOI: 10.1016/j.tips.2020.06.003

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Balduino, PR, Lyumkis, D. Herramientas para visualizar y analizar el muestreo espacial de Fourier en Cryo-EM. (2020) Avances en Biofísica y Biología Molecular. DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2020.06.003

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Brugger, C., Zhang, C., Suhanovsky, MM, Kim, DD, Sinclair, AN, Lyumkis, D., Deaconescu, AM Determinantes moleculares para la translocación de dsDNA por el acoplamiento de reparación de la transcripción y el factor de evolución Mfd. (2020) Nature Communications. 11(1):3740. DOI: 10.1038/s41467-020-17457-1

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Smith, SJ, Zhao, XZ, Passos, DO, Lyumkis, D., Burke, TR, Hughes, SH Inhibidores de la integrasa del VIH-1 que son activos contra los mutantes de la integrasa resistentes a los medicamentos. (2020) Agentes antimicrobianos y quimioterapia. DOI: 10.1128/AAC.00611-20

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El tratamiento de primera línea actualmente recomendado para los pacientes infectados por el VIH-1 es un inhibidor de la transferencia de cadena (INSTI) de la integrasa (IN) de segunda generación, ya sea dolutegravir (DTG) o bictegravir (BIC), en combinación con dos inhibidores de la transcriptasa inversa nucleósidos (NRTI) . Tanto DTG como BIC inhiben potentemente la mayoría de los mutantes IN resistentes a INSTI seleccionados por INSTI de primera generación. No se ha informado que BIC seleccione por resistencia en pacientes sin tratamiento previo y DTG ha seleccionado una pequeña cantidad de virus resistentes en pacientes sin tratamiento previo. Sin embargo, algunos pacientes que tenían virus con sustituciones seleccionadas por INSTI de primera generación respondieron mal cuando cambiaron a terapias basadas en DTG, y hay mutantes que causan una disminución considerable en las potencias de DTG y BIC en los ensayos. Se ha demostrado que el nuevo INSTI Cabotegravir (CAB), que se encuentra en las últimas etapas de los ensayos clínicos, selecciona nuevos mutantes resistentes. Por lo tanto, es importante desarrollar nuevos y mejorados INSTI que sean efectivos contra todos los mutantes resistentes conocidos. Esto nos llevó a probar nuestros mejores inhibidores, en paralelo con DTG, BIC y CAB, en un ensayo de infección de una sola ronda contra un panel de los nuevos mutantes resistentes a CAB. De los INSTI que probamos, BIC y nuestro compuesto tuvieron la eficacia más amplia. Ambos fueron superiores a DTG, como lo demuestran los datos obtenidos con el mutante IN T66I/L74M/E138K/S147G/Q148R/S230N, que fue seleccionado por CAB utilizando una cepa de laboratorio resistente a EVG. Estos resultados respaldan el desarrollo preclínico y brindan información que puede usarse en el diseño de INSTI adicionales que serán efectivos contra un amplio espectro de mutantes resistentes.

Passos, DO, Li, M., Jóźwik, IK, Zhao, XZ, Santos-Martins, D., Yang, R., Smith, SJ, Jeon, Y., Forli, S., Hughes, SH, Burke, TR , Craigie, R., Lyumkis, D. Base estructural para la unión del inhibidor de transferencia de cadena a los intrasomas del VIH. (2020) Ciencia. DOI: 10.1126/ciencia.aay8015

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Rabuck-Gibbons, JN, Popova, AM, Greene, EM, Cervantes, CF, Lyumkis, D., Williamson, JR SrmB rescata intermedios de ensamblaje de ribosomas atrapados. (2019) Revista de Biología Molecular. DOI: 10.1016/j.jmb.2019.12.013

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Balduino, PR, Lyumkis, D. La falta de uniformidad de las distribuciones de proyección atenúa la resolución en Cryo-EM. (2019) prog. Biografía. mol. Biol. DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2019.09.002

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Polley, S., Lyumkis, D., Horton, Carolina del Norte Mecanismo de activación alostérica inducida por filamentación de la endonucleasa SgrAI. (2019) Estructura. 27(10):1497-1507. DOI: 10.1016/j.str.2019.08.001

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Haack, DB, Yan, X., Zhang, C., Hingey, J., Lyumkis, D., Baker, TS, Toor, N. Estructuras crio-EM de un empalme inverso del intrón del grupo II en el ADN. (2019) Cell. 178(3):612-623.e12. DOI: 10.1016/j.cell.2019.06.035

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Koneru, PC, Francis, AC, Deng, N., Rebensburg, SV, Hoyte, AC, Lindenberger, J., Adu-Ampratwum, D., Larue, RC, Wempe, MF, Engelman, AN, Lyumkis, D., Fuchs, JR, Levy, RM, Melikyan, GB, Kvaratskhelia, M. Los tetrámeros de la integrasa del VIH-1 son el objetivo antiviral de los inhibidores de la integrasa alostérica basados en piridina. (2019) Elife. 8. DOI: 10.7554/eLife.46344

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Lyumkis, D. Desafíos y oportunidades en el análisis de partículas individuales Cryo-EM. (2019) Revista de Química Biológica. DOI: 10.1074/jbc.REV118.005602

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Zhang, C., Cantara, W., Jeon, Y., Musier-Forsyth, K., Grigorieff, N., Lyumkis, D. Análisis de variabilidad local discreta y covarianza estructural en ensamblajes macromoleculares utilizando Cryo-EM y clasificación enfocada. (2018) Ultramicroscopía. DOI: 10.1016/j.ultramic.2018.11.016

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Tan, YZ, Aiyer, S., Mietzsch, M., Hull, JA, McKenna, R., Grieger, J., Samulski, RJ, Baker, TS, Agbandje-McKenna, M., Lyumkis, D. Sub-2 Å Estructura corregida de curvatura de Ewald de una variante de cápside de AAV2. (2018) Nature Communications. 9(1):3628. DOI: 10.1038/s41467-018-06076-6

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Zhang, C., Konermann, S., Brideau, NJ, Lotfy, P., Wu, X., Novick, SJ, Strutzenberg, T., Griffin, PR, Hsu, PD, Lyumkis, D. Base estructural para la actividad de ribonucleasa guiada por ARN de CRISPR-Cas13d. [Publicado] (2018) Cell. 175(1):212-223.e17. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.001

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Tan, YZ, Baldwin, PR, Davis, JH, Williamson, JR, Potter, CS, Carragher, B., Lyumkis, D. Abordar la orientación preferida de la muestra en crio-EM de una sola partícula a través de la inclinación. (2017) Métodos de la naturaleza. 14(8):793-796. DOI: 10.1038/nmet.4347

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Ozorowski, G., Pallesen, J., de Val, N., Lyumkis, D., Cottrell, CA, Torres, JL, Copps, J., Stanfield, RL, Cupo, A., Pugach, P., Moore, JP, Wilson, IA, Ward, AB Las estructuras abiertas y cerradas revelan alostería y flexibilidad en la espiga de la envoltura del VIH-1. (2017) Naturaleza. 547 (7663): 360-363. DOI: 10.1038/naturaleza23010

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Para muchos virus envueltos, la unión a uno o más receptores en una célula huésped actúa como el primer paso en una serie de eventos que culminan en la fusión con la membrana de la célula huésped y la transferencia de material genético para la replicación. El trímero de glicoproteína de envoltura (Env) en la superficie del VIH es responsable de la unión y fusión del receptor. Aunque Env puede tolerar un alto grado de mutación en cinco regiones variables (V1-V5), y también en sitios de glicosilación ligados a N que contribuyen aproximadamente con la mitad de la masa de Env, los sitios funcionales para el reconocimiento del receptor CD4 y el correceptor CXCR4/ CCR5 se conservan y son esenciales para la aptitud viral. Los trímeros SOSIP Env solubles son miméticos estructurales y antigénicos del Env nativo presentado en la superficie antes de la fusión, y son objetivos de anticuerpos ampliamente neutralizantes. Por tanto, son inmunógenos atractivos para el desarrollo de vacunas. Aquí presentamos estructuras de microscopía crioelectrónica de alta resolución de trímeros SOSIP Env de subtipo B B41 en complejo con CD4 y anticuerpo 17b, o con anticuerpo b12, a resoluciones de 3.7 Å y 3.6 Å, respectivamente. Los comparamos con reconstrucciones de microscopía electrónica criogénica de trímeros B41 SOSIP Env sin ligando o en complejo con CD4 o el anticuerpo PGV4 del sitio de unión a CD04 a una resolución de 5.6 Å, 5.2 Å y 7.4 Å, respectivamente. En consecuencia, presentamos la descripción más completa hasta el momento, según nuestro conocimiento, del intermedio inducido por CD4-17b y proporcionamos la base molecular del cambio conformacional inducido por la unión al receptor requerido para la entrada del VIH-1 en las células huésped. Tanto CD4 como b12 inducen grandes reordenamientos conformacionales previamente no caracterizados en las subunidades gp41, y el péptido de fusión queda enterrado en un bolsillo recién formado. Estas estructuras brindan detalles clave sobre la función biológica de la máquina de fusión viral tipo I del VIH-1, así como nuevas plantillas para el diseño de inhibidores.

Passos, DO, Li, M., Yang, R., Rebensburg, SV, Ghirlando, R., Jeon, Y., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Craigie, R., Lyumkis, D. Estructuras crio-EM y modelo atómico del complejo de transferencia de cadenas de VIH-1 en el intasoma. (2017) Ciencia. 355(6320):89-92. DOI: 10.1126/ciencia.aah5163

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Davis, JH, Tan, YZ, Carragher, B., Potter, CS, Lyumkis, D., Williamson, JR Ensamblaje Modular de la Subunidad Ribosomal Grande Bacteriana. (2016) Cell. 167(6):1610-1622.e15. DOI: 10.1016/j.cell.2016.11.020

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Polley, S., Passos, DO, Huang, DB, Mulero, MC, Mazumder, A., Biswas, T., Verma, IM, Lyumkis, D., Ghosh, G. Base estructural para la activación de IKK1/α. (2016) Informes de celda. 17(8):1907-1914. DOI: 10.1016/j.celrep.2016.10.067

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Ballandras-Colas, A., Brown, M., Cook, NJ, Dewdney, TG, Demeler, B., Cherepanov, P., Lyumkis, D., Engelman, AN Cryo-EM revela una nueva estructura de integrasa octámera para la función del intasoma betaretroviral. (2016) Naturaleza. 530 (7590): 358-61. DOI: 10.1038/naturaleza16955

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La integrasa retroviral cataliza la integración del ADN viral en el ADN objetivo del huésped, que es un paso esencial en el ciclo de vida de todos los retrovirus. La caracterización estructural previa de complejos de integrasa-ADN viral, o intasomas, del virus espumoso prototipo de spumavirus reveló un tetrámero de integrasa funcional, y generalmente se cree que los intasomas derivados de otros géneros retrovirales usan integrasa tetramérica. Sin embargo, los intasomas de los ortoretrovirus, que incluyen todas las especies patógenas conocidas, no se han caracterizado estructuralmente. Aquí, utilizando microscopía crioelectrónica de una sola partícula y cristalografía de rayos X, determinamos una arquitectura de integrasa octámera inesperada para el intestino del virus del tumor mamario de ratón betaretrovirus. La estructura se compone de dos dímeros de integrasa centrales, que interactúan con los extremos del ADN viral e imitan estructuralmente al tetrámero de integrasa del prototipo de virus espumoso, y dos dímeros de integrasa flanqueantes que se acoplan a la estructura central a través de sus dominios carboxi-terminales de integrasa. Contrariamente a la creencia de que los componentes de la integrasa tetramérica son suficientes para catalizar la integración, los dímeros de la integrasa flanqueantes eran necesarios para la actividad de la integrasa del virus del tumor mamario de ratón. El octámero de integrasa resuelve un enigma para los betaretrovirus y los alfaretrovirus al proporcionar dominios carboxi-terminales críticos al núcleo del intasoma que no se pueden proporcionar en cis debido a las regiones conectoras de dominio carboxi-terminal del dominio del núcleo catalítico evolutivamente restrictivas. La arquitectura octámera del intasoma del virus del tumor mamario de ratón proporciona una nueva perspectiva sobre la base estructural de la integración del ADN retroviral.

Pasos, DO, Lyumkis, D. Análisis cryoEM de una sola partícula a una resolución casi atómica de varios miles de subunidades asimétricas. (2015) Revista de Biología Estructural. 192(2):235-44. DOI: 10.1016/j.jsb.2015.10.002

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Lee, JH, de Val, N., Lyumkis, D., Barrio, AB Construcción de modelos y refinamiento de una proteína Env de VIH-1 glicosilada de forma nativa mediante microscopía crioelectrónica de alta resolución. (2015) Estructura. 23(10):1943-51. DOI: 10.1016/j.str.2015.07.020

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Lyumkis, D., Oliveira dos Passos, D., Tahara, EB, Webb, K., Bennett, EJ, Vinterbo, S., Potter, CS, Carragher, B., Joazeiro, CA Base estructural para la vigilancia traslacional por el gran complejo de control de calidad de proteínas asociado a subunidades ribosómicas. (2014) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 111(45):15981-6. DOI: 10.1073/pnas.1413882111

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Sashital, DG, Greenman, California, Lyumkis, D., Potter, CS, Carragher, B., Williamson, JR Un análisis combinado de espectrometría de masas cuantitativa y microscopía electrónica del ensamblaje de la subunidad ribosomal 30S en E. coli. (2014) Elife. 3. DOI: 10.7554/eLife.04491

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Lyumkis, D., Julien, JP, de Val, N., Cupo, A., Potter, CS, Klasse, PJ, Burton, DR, Sanders, RW, Moore, JP, Carragher, B., Wilson, IA, Ward, AB Estructura crio-EM de un trímero de envoltura de VIH-1 escindido soluble completamente glicosilado. (2013) Ciencia. 342 (6165): 1484-90. DOI: 10.1126/ciencia.1245627

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Julien, JP, Cupo, A., Sok, D., Stanfield, RL, Lyumkis, D., Deller, MC, Klasse, PJ, Burton, DR, Sanders, RW, Moore, JP, Ward, AB, Wilson, IA Estructura cristalina de un trímero de envoltura de VIH-1 escindido soluble. (2013) Ciencia. 342 (6165): 1477-83. DOI: 10.1126/ciencia.1245625

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Lyumkis, D., Vinterbo, S., Potter, CS, Carragher, B. Optimod: un enfoque automatizado para construir y optimizar modelos iniciales para microscopía electrónica de partículas individuales. (2013) Revista de Biología Estructural. 184(3):417-26. DOI: 10.1016/j.jsb.2013.10.009

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La microscopía crioelectrónica de partículas individuales ahora está bien establecida como una técnica para la caracterización estructural de macromoléculas grandes y complejos macromoleculares. Los datos sin procesar son muy ruidosos y consisten en proyecciones bidimensionales, a partir de las cuales se debe reconstruir el objeto biológico 3D. El objeto 3D depende del conocimiento de las orientaciones angulares apropiadas asignadas a las imágenes de proyección 2D. Se han desarrollado numerosos algoritmos para determinar orientaciones angulares relativas entre imágenes 2D, pero la transición de 2D a 3D sigue siendo un desafío y puede generar resultados erróneos y contradictorios. Aquí describimos un procedimiento automatizado general, llamado OptiMod, para reconstruir y optimizar modelos 3D utilizando metodologías de líneas comunes. OptiMod aproxima los ángulos de orientación y reconstruye mapas independientes a partir de promedios de clase 2D. Luego itera el procedimiento, mientras considera cada mapa como una solución sin procesar que debe compararse con otros resultados posibles. Incorporamos procedimientos de alineación, agrupación y refinamiento 3D para optimizar cada mapa, así como métricas de puntuación estándar para facilitar la selección del modelo óptimo. También mostramos que los datos de par de inclinación de ángulo pequeño se pueden incluir como una de las métricas de puntuación para mejorar la selección del modelo inicial óptimo y también para proporcionar una verificación de validación. El enfoque general se demuestra utilizando dos conjuntos de datos crio-EM experimentales: el ribosoma 80S que representa un caso relativamente sencillo para la reconstrucción ab initio, y el complejo Tf-TfR que representa un caso desafiante en el que se ha demostrado anteriormente que proporciona múltiples soluciones igualmente plausibles al problema del modelo inicial.

Lyumkis, D., Talley, H., Stewart, A., Shah, S., Park, CK, Tama, F., Potter, CS, Carragher, B., Horton, NC Regulación alostérica de la escisión del ADN y la especificidad de secuencia a través de la oligomerización continua. (2013) Estructura. 21(10):1848-58. DOI: 10.1016/j.str.2013.08.012

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Lyumkis, D., Brilot, AF, Theobald, DL, Grigorieff, N. Clasificación basada en la probabilidad de imágenes crio-EM utilizando FREALIGN. (2013) Revista de Biología Estructural. 183(3):377-388. DOI: 10.1016/j.jsb.2013.07.005

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Yoshioka, C., Lyumkis, D., Carragher, B., Potter, CS Maskiton: clasificación interactiva basada en la web de imágenes de microscopía electrónica de partículas individuales. (2013) Revista de Biología Estructural. 182(2):155-63. DOI: 10.1016/j.jsb.2013.02.007

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Lyumkis, D., Doamekpor, SK, Bengtson, MH, Lee, JW, Toro, TB, Petroski, MD, Lima, CD, Potter, CS, Carragher, B., Joazeiro, CA La EM de una sola partícula revela una amplia variabilidad conformacional de la ligasa Ltn1 E3. (2013) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 110(5):1702-7. DOI: 10.1073/pnas.1210041110

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Campbell, MG, Cheng, A., Brilot, AF, Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, SC, Potter, CS, Carragher, B., Grigorieff, N. Las películas de partículas incrustadas en hielo mejoran la resolución en la criomicroscopía electrónica. (2012) Estructura. 20(11):1823-8. DOI: 10.1016/j.str.2012.08.026

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Milazzo, AC, Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, MH, Xuong, NH, Carragher, B., Potter, CS Evaluación inicial de un detector de dispositivo de detección directa para microscopía crioelectrónica de partículas individuales. (2011) Revista de Biología Estructural. 176(3):404-8. DOI: 10.1016/j.jsb.2011.09.002

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Voss, NR, Lyumkis, D., Cheng, A., Lau, PW, Mulder, A., Lander, GC, Brignole, EJ, Fellmann, D., Irving, C., Jacovetty, EL, Leung, A., Pulokas, J., Quispe, JD , Winkler, H., Yoshioka, C., Carragher, B., Potter, CS Una caja de herramientas para reconstrucciones tridimensionales ab initio en microscopía electrónica de partículas individuales. (2010) Revista de Biología Estructural. 169(3):389-98. DOI: 10.1016/j.jsb.2009.12.005

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Lyumkis, D., Moeller, A., Cheng, A., Herold, A., Hou, E., Irving, C., Jacovetty, EL, Lau, PW, Mulder, AM, Pulokas, J., Quispe, JD, Voss, NR , Potter, CS, Carragher, B. Automatización en microscopía electrónica de partículas individuales conectando las piezas. (2010) metanfetamina Enzimol. 483:291-338. DOI: 10.1016/S0076-6879(10)83015-0

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A lo largo de la historia de la microscopía electrónica (EM) de una sola partícula, las tecnologías automatizadas han experimentado diversos grados de énfasis y desarrollo, generalmente dependiendo de las demandas contemporáneas del campo. Actualmente nos enfrentamos a dispositivos cada vez más sofisticados para la preparación de muestras, grandes aumentos en el tamaño de los conjuntos de datos recopilados, algoritmos integrales para el procesamiento de imágenes, herramientas sofisticadas para la evaluación de la calidad y una afluencia de científicos interesados fuera del campo que pueden carecer de las habilidades de microscopistas experimentados. Esta situación hace que las técnicas automatizadas tengan una gran demanda. En este capítulo, proporcionamos una definición genérica y analizamos algunos de los avances más importantes en los enfoques automatizados para la preparación de muestras, el manejo de cuadrículas, la detección robótica, las calibraciones de microscopios, la adquisición de datos, el procesamiento de imágenes y la infraestructura computacional. Cada sección describe el problema general y luego proporciona ejemplos de cómo se ha abordado ese problema a través de la automatización, destacando los paquetes de procesamiento disponibles y, a veces, describiendo el enfoque particular en National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM). Contrastamos los procedimientos manuales más familiares con los enfoques automatizados, enfatizando los avances y las limitaciones actuales. Finalmente, especulamos sobre futuras direcciones y mejoras en tecnologías automatizadas. Nuestro objetivo general es presentar la automatización como algo más que una simple herramienta para ahorrar tiempo. Más bien, nuestro objetivo es ilustrar que la automatización es una estrategia integral y versátil que puede brindar información biológica en una escala sin precedentes más allá del alcance disponible con los enfoques manuales clásicos.

Lander, GC, Stagg, SM, Voss, NR, Cheng, A., Fellmann, D., Pulokas, J., Yoshioka, C., Irving, C., Mulder, A., Lau, PW, Lyumkis, D., Potter, CS, Carragher, B. Appion: una canalización integrada basada en bases de datos para facilitar el procesamiento de imágenes EM. (2009) Revista de Biología Estructural. 166(1):95-102. DOI: 10.1016/j.jsb.2009.01.002

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Dr. Dmitry Lyumkis

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