Entschlüsselung der Struktur eines RNA-basierten CRISPR-Systems

Entschlüsselung der Struktur eines RNA-basierten CRISPR-Systems

Forscher des Salk Institute entdecken molekulare Details eines neuen gentechnischen Werkzeugs

LA JOLLA – In den letzten Jahren ist CRISPR-Cas9 über den Labortisch hinaus in den öffentlichen Zeitgeist vorgedrungen. Dieses Gen-Editing-Tool verspricht die Korrektur von Defekten in einzelnen Zellen und möglicherweise die Heilung oder Vorbeugung vieler menschlicher Krankheiten. Aber das Cas9-System verändert DNA, nicht RNA, und einige Experten glauben, dass sich die Möglichkeit, RNA zu modifizieren, letztendlich als ebenso nützlich erweisen könnte.

Jetzt berichten Wissenschaftler des Salk Institute zum ersten Mal über die detaillierte Molekülstruktur von CRISPR-Cas13d, einem vielversprechenden Enzym für die neue RNA-Editierungstechnologie. Dank der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), einer hochmodernen Technologie, die es Forschern ermöglicht, die Struktur komplexer Moleküle in beispielloser Detailgenauigkeit zu erfassen, konnten sie das Enzym sichtbar machen. Die Ergebnisse wurden am 20. September 2018 in der Zeitschrift veröffentlicht Zelle.

„Dieses Papier liefert einen molekularen Plan für die RNA-zielgerichtete Gentechnik“, sagt Salk-Assistentprofessor Dmitri Ljumkis, ein Strukturbiologe und einer der korrespondierenden Autoren der Studie. „Es erweitert die Bandbreite der Werkzeuge, die für die Durchführung dieser wichtigen biomedizinischen Forschung erforderlich sind.“

CRISPR wurde von Genen abgeleitet, die ursprünglich in Bakterien vorkommen, und wurde als „molekulare Schere“ oder „Textverarbeitungsprogramm für lebende Zellen“ beschrieben. Es tauscht ein Segment des genetischen Codes gegen ein anderes aus. Im CRISPR-Cas9-System ist Cas9 das Enzym, das DNA schneidet. Mit Bearbeitungswerkzeugen für RNA könnten Wissenschaftler jedoch die Aktivität eines Gens verändern, ohne eine dauerhafte – und möglicherweise gefährliche – Veränderung am Gen selbst vorzunehmen.

„Die DNA ist konstant, aber was sich ständig ändert, sind die RNA-Botschaften, die von der DNA kopiert werden“, sagt Silvana Konermann, Forschungsmitarbeiterin bei Salk, Hanna Gray Fellow am Howard Hughes Medical Institute und eine der Erstautorinnen der Studie. „Die Möglichkeit, diese Botschaften durch direkte Steuerung der RNA zu modulieren, hat wichtige Auswirkungen auf die Beeinflussung des Schicksals einer Zelle.“

Anfang des Jahres haben Konermann und Helmsley-Salk-Stipendiat Patrick Hsu veröffentlichte einen weiteren Artikel in Zelle Entdeckung der Enzymfamilie namens CRISPR-Cas13d und Bericht, dass dieses alternative CRISPR-System bei der Erkennung und Zerschneidung von RNA wirksam war. Das Team zeigte auch, dass dieses Tool verwendet werden kann, um ein krankheitsverursachendes Proteinungleichgewicht in den Zellen einer Person mit Demenz zu korrigieren.

Die neue Studie, eine Zusammenarbeit zwischen den Labors von Lyumkis und Hsu, baut auf der Entdeckung der Cas13d-Familie auf und liefert die molekularen Details, die ihre Funktionsweise erklären.

„In unserer vorherigen Arbeit haben wir eine neue CRISPR-Familie entdeckt, mit der sich RNA direkt in menschlichen Zellen manipulieren lässt“, sagt Hsu, der andere korrespondierende Autor der neuen Arbeit. „Da wir nun die Struktur von Cas13d visualisieren konnten, können wir genauer sehen, wie das Enzym zur RNA geleitet wird und wie es in der Lage ist, die RNA zu schneiden. Diese Erkenntnisse ermöglichen es uns, das System zu verbessern und den Prozess effektiver zu gestalten und so den Weg für neue Strategien zur Behandlung von RNA-basierten Krankheiten zu ebnen.“

Das Team nutzte Kryo-EM, um neue Details zu Cas13d zu enthüllen, indem es das Enzym in verschiedenen, dynamischen Zuständen einfrierte, was es den Forschern ermöglichte, eine Reihe von Aktivitäten zu entschlüsseln, anstatt nur eine Aktivität zu einem einzigen Zeitpunkt zu sehen.

„Dadurch konnten wir sehen, wie Cas13d die RNA leitet, bindet und angreift“, sagt Cheng Zhang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter im Lyumkis-Labor und der andere Erstautor der Arbeit. „Wir hoffen, dass dieses neue Wissen dazu beitragen wird, die Leistungsfähigkeit der Werkzeuge zur Genbearbeitung zu erweitern.“

Die anderen Autoren der Zeitung waren Nicholas J. Brideau und Peter Lotfy von Salk; Xuebing Wu vom Whitehead Institute for Biomedical Research; und Scott J. Novick, Timothy Strutzenberg und Patrick R. Griffin vom Scripps Research Institute.

Diese Arbeit wurde durch ein Hannah H. Gray-Stipendium des Howard Hughes Medical Institute unterstützt; ein Stipendium der Helen Hay Whitney Foundation; National Institutes of Health gewährt NIH-NCI CCSG P30 014195, DP5 OD021369, DP5 OD021396 und U54GM103368; und der Helmsley Charitable Trust.