Publications - Salk Institute for Biological Studies

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2025

Kumar, A.J., Epler, K., Wang, J., Shen, A., Samandari, N., Rolfsen, M.L., Barnes, L.A., Shadel, G.S., Moyzis, A.G., Sainz, A.G., Ulubabyan, K., Li, K., Jepsen, K., Li, X., Fuster, M.M., Spragg, R.G., Sasik, R., Vallon, V., Goodluck, H., Ix, J.H., Singh, P., Hepokoski, M.L. El ADN mitocondrial del riñón contribuye a la liberación sistémica de IL-6 en la lesión renal aguda asociada a la sepsis. (2025) JCI Insight. 10(23). DOI: 10.1172/jci.insight.177004

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Esparza-Moltó, P.B., Goswami, A.V., Bozkurt, S., Münch, C., Newman, L.E., Moyzis, A.G., Rojas, G.R., Guan, D., Jones, J.R., Gage, F.H., Shadel, G.S. Localización de enzimas glucolíticas en mitocondrias dependiente de ROS. (2025) Redox Biol. 86:103812. DOI: 10.1016/j.redox.2025.103812

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Las especies reactivas del oxígeno mitocondrial (mtROS) regulan las vías de señalización celular, pero también provocan estrés oxidativo cuando se desregulan durante el envejecimiento y en condiciones patológicas como las enfermedades neurodegenerativas. La redistribución dinámica de proteínas entre los compartimentos celulares es un mecanismo común para controlar su estabilidad y actividades biológicas. Al dirigir la biotina ligasa BirA∗ hacia la membrana mitocondrial externa en células HEK293, identificamos proteínas cuyo marcaje aumentó o disminuyó en respuesta al tratamiento con menadiona, lo cual concuerda con un cambio dinámico en su localización mitocondrial en respuesta al aumento de la producción de mtROS. Estas proteínas representan candidatos potenciales para futuros estudios sobre la señalización del estrés oxidativo mitocondrial. En este cribado se encontró un subconjunto de enzimas glucolíticas y se confirmó, mediante fraccionamiento mitocondrial e imágenes, que aumentaban su localización en las mitocondrias en respuesta a la menadiona, a pesar de que no se observó ningún cambio en su abundancia general. Los estudios de fraccionamiento submitocondrial concuerdan con la importación de un conjunto de estas enzimas al espacio intermembranario mitocondrial. La localización de las enzimas glucolíticas en las mitocondrias también aumentó en células cultivadas en condiciones de hipoxia o que expresan una d-aminoacido oxidasa dirigida a las mitocondrias (condiciones que inducen un aumento en la producción de ROS mitocondriales), y se inhibió de forma basal en condiciones normales de crecimiento mediante el antioxidante mitocondrial MnTBAP. Por último, los fibroblastos de la enfermedad de Alzheimer primaria también presentaban enzimas glucolíticas asociadas a las mitocondrias que se reducían con los antioxidantes, lo que concuerda con el aumento de mtROS que altera su distribución relativa entre el citoplasma y las mitocondrias. Especulamos que el aumento de la localización mitocondrial de las enzimas glucolíticas es una respuesta adaptativa a los mtROS que altera el flujo de glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato antioxidante, crea reservorios reguladores distintos de metabolitos mitocondriales o nuevos circuitos metabólicos, y/o proporciona citoprotección u otras respuestas adaptativas a través de funciones secundarias no relacionadas con su actividad enzimática.

Sainz, A.G., Rojas, G.R., Moyzis, A.G., Donnelly, M.P., Mangalhara, K.C., Johnson, M.A., Esparza-Moltó, P.B., Grae, K.J., Shaw, R.J., Shadel, G.S. FAM43A coordina la replicación del ADN mitocondrial y la biogénesis mitocondrial en respuesta al agotamiento del ADN mitocondrial. (2025) Revista de Biología Celular. 224(3). DOI: 10.1083/jcb.202311082

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Varanasi, S.K., Chen, D., Liu, Y., Johnson, M.A., Miller, C.M., Ganguly, S., Lande, K., LaPorta, M.A., Hoffmann, F.A., Mann, T.H., Teneche, M.G., Casillas, E., Mangalhara, K.C., Mathew, V., Sun, M., Jensen, I.J., Farsakoglu, Y., Chen, T., Parisi, B., Deota, S., Havas, A., Lee, J., Chung, H.K., Schietinger, A., Panda, S., Williams, A.E., Farber, D.L., Dhar, D., Adams, P.D., Feng, G.S., Shadel, G.S., Sundrud, M.S., Kaech, S.M. La síntesis de ácidos biliares impide las respuestas de las células T específicas del tumor durante el cáncer de hígado. (2025) Ciencia. 387(6730):192-201. DOI: 10.1126/science.adl4100

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2024

Schiavon, C.R., Wang, Y., Feng, J.W., Garrett, S., Sung, T.C., Dayn, Y., Wang, C., Youle, R.J., Quintero-Carmona, O.A., Shadel, G.S., Mansión, U. La polimerización de actina mediada por INF2 en los contactos entre el retículo endoplasmático y otros orgánulos regula el tamaño y el movimiento de los orgánulos. (2024) Res. Cuadrado. DOI: 10.21203/rs.3.rs-4720604/v1

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Phang, H.J., Heimler, S.R., Scandalis, L.M., Wing, D., Moran, R., Nichols, J.F., Moreno, D., Shadel, G.S., Gage, F.H., Molina, A.J.A. Protocolo para la Cohorte Clínica del Centro Nathan Shock de San Diego: un nuevo recurso para estudios de envejecimiento humano. (2024) BMJ Open. 14(6):e082659. DOI: 10.1136/bmjopen-2023-082659

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Maxwell, M.B., Hom-Tedla, M.S., Yi, J., Li, S., Rivera, S.A., Yu, J., Burns, M.J., McRae, H.M., Stevenson, B.T., Coakley, K.E., Ho, J., Gastelum, K.B., Bell, J.C., Jones, A.C., Eskander, R.N., Dykhuizen, E.C., Shadel, G.S., Kaech, S.M., Hargreaves, D.C. ARID1A suprime la activación de la vía STING tipo I de interferón mediada por R-loops de la inmunidad antitumoral. (2024) Móvil. DOI: 10.1016/j.cell.2024.04.025

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Newman, L.E., Weiser Novak, S., Rojas, G.R., Tadepalle, N., Schiavon, C.R., Grotjahn, D.A., Towers, C.G., Tremblay, M., Donnelly, M.P., Ghosh, S., Medina, M., Rocha, S., Rodriguez-Enriquez, R., Chevez, J.A., Lemersal, I., Manor, U., Shadel, G.S. El estrés en la replicación del ADN mitocondrial desencadena una vía endosomal proinflamatoria de eliminación de nucleoides. (2024) Naturaleza y Biología Celular. DOI: 10.1038/s41556-023-01343-1

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El ADN mitocondrial (ADNmt) codifica subunidades esenciales del sistema de fosforilación oxidativa, pero también es un importante patrón molecular asociado al daño (DAMP) que activa los sensores del sistema inmunitario innato cuando se libera en el citoplasma, fuera de las células o en la circulación. Como DAMP, el ADNmt no solo contribuye a la resistencia antiviral, sino que también provoca inflamación patógena en muchos contextos patológicos. Las células que experimentan estrés de mtDNA causado por el agotamiento de la proteína de empaquetamiento del mtDNA, el factor de transcripción A mitocondrial (TFAM), o durante la infección por el virus del herpes simple tipo 1, presentan mitocondrias alargadas, agrandamiento de los nucleoides (complejos de mtDNA y proteínas) y activación de la señalización inmunitaria innata cGAS-STING a través del mtDNA liberado en el citoplasma. Sin embargo, la relación entre las mitocondrias anómalas y la dinámica de los nucleoides, la liberación de ADNmt y la activación de cGAS-STING sigue sin estar clara. Aquí mostramos que, bajo diversas condiciones de estrés de replicación del ADNmt y durante la infección por el virus del herpes simple tipo 1, los nucleoides agrandados que permanecen unidos a TFAM salen de las mitocondrias. Los nucleoides agrandados surgen del ADNmt que experimenta estrés de replicación, lo que provoca la agrupación de nucleoides a través de un bloqueo en la fisión mitocondrial en una etapa en la que normalmente comenzaría la polimerización de actina del retículo endoplásmico, definiendo un punto de control de fisión que garantiza que el ADNmt haya completado la replicación y sea competente para la segregación en mitocondrias hijas. La activación crónica de este punto de control da lugar a que los nucleoides agrandados sean transportados a los endosomas tempranos y luego a los tardíos para su eliminación. La ruptura endosómica durante el tránsito a través de esta vía endosómica provoca en última instancia la activación de cGAS-STING mediada por el ADNmt. Por lo tanto, proponemos que los nucleoides incompetentes para la replicación son eliminados selectivamente por una vía adaptativa de control de calidad mitocondrial-endosómica que es propensa a la activación del sistema inmunitario innato, lo que podría representar un objetivo terapéutico para prevenir la inflamación mediada por el ADNmt durante la infección viral y otros estados patógenos.

2023

Victorelli, S., Salmonowicz, H., Chapman, J., Martini, H., Vizioli, M.G., Riley, J.S., Cloix, C., Hall-Younger, E., Machado Espindola-Netto, J., Jurk, D., Lagnado, A.B., Sales Gomez, L., Farr, J.N., Saul, D., Reed, R., Kelly, G., Eppard, M., Greaves, L.C., Dou, Z., Pirius, N., Szczepanowska, K., Porritt, R.A., Huang, H., Huang, T.Y., Mann, D.A., Masuda, C.A., Khosla, S., Dai, H., Kaufmann, S.H., Zacharioudakis, E., Gavathiotis, E., LeBrasseur, N.K., Lei, X., Sainz, A.G., Korolchuk, V.I., Adams, P.D., Shadel, G.S., Tait, S.W.G., Passos, J.F. El estrés apoptótico provoca la liberación de ADN mitocondrial durante la senescencia e impulsa el SASP. (2023) Naturaleza. DOI: 10.1038/s41586-023-06621-4

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Mangalhara, K.C., Varanasi, S.K., Johnson, M.A., Burns, M.J., Rojas, G.R., Esparza Moltó, P.B., Sainz, A.G., Tadepalle, N., Abbott, K.L., Mendiratta, G., Chen, D., Farsakoglu, Y., Kunchok, T., Hoffmann, F.A., Parisi, B., Rincon, M., Vander Heiden, M.G., Bosenberg, M., Hargreaves, D.C., Kaech, S.M., Shadel, G.S. Manipular el flujo de electrones mitocondrial mejora la inmunogenicidad tumoral. (2023) Ciencia. 381(6664):1316-1323. DOI: 10.1126/science.abq1053

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Lei, Y., VanPortfliet, J.J., Chen, Y.F., Bryant, J.D., Li, Y., Fails, D., Torres-Odio, S., Ragan, K.B., Deng, J., Mohan, A., Wang, B., Brahms, O.N., Yates, S.D., Spencer, M., Tong, C.W., Bosenberg, M.W., West, L.C., Shadel, G.S., Shutt, T.E., Upton, J.W., Li, P., West, A.P. La detección cooperativa de ADN mitocondrial por ZBP1 y cGAS promueve la cardiotoxicidad. (2023) Móvil. DOI: 10.1016/j.cell.2023.05.039

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Al Khatib, I., Deng, J., Lei, Y., Torres-Odio, S., Rojas, G.R., Newman, L.E., Chung, B.K., Symes, A., Zhang, H., Huang, S.N., Pommier, Y., Khan, A., Shadel, G.S., West, A.P., Gibson, W.T., Shutt, T.E. Activación de la respuesta inmune innata cGAS-STING en células con deficiencia de la topoisomerasa mitocondrial TOP1MT. (2023) Genética Molecular Humana. DOI: 10.1093/hmg/ddad062

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El descubrimiento de que el ADN mitocondrial citosólico activa la señalización inmunitaria innata cGAS-STING ha revelado nuevos mecanismos patológicos. En este estudio, se descubrió una variante no caracterizada, P193L, que se prevé que afecte a la función de TOP1MT, en una familia con múltiples enfermedades autoinmunes de aparición temprana, incluido el lupus eritematoso sistémico (LES). Aunque no existía una asociación genética previa entre TOP1MT y las enfermedades autoinmunes, el papel de TOP1MT como regulador del ADNmt nos llevó a investigar si TOP1MT podría mediar la liberación de ADNmt al citosol, donde podría activar la vía inmunitaria innata cGAS-STING, conocida por activarse en el LES y otras enfermedades autoinmunes. Mediante el análisis de células con expresión reducida de TOP1MT, demostramos que la pérdida de TOP1MT da lugar a la liberación de ADNmt al citosol, lo que activa la vía cGAS-STING. También caracterizamos la variante P193L por su capacidad para rescatar varias funciones de TOP1MT cuando se expresa en células con deleción de TOP1MT. Demostramos que la variante P193L no es totalmente funcional, ya que su reexpresión a niveles elevados no fue capaz de rescatar los déficits de respiración mitocondrial, y solo mostró un rescate parcial de otras funciones, incluyendo la reposición de la replicación del ADNmt tras su agotamiento, el tamaño del nucleoide, los niveles de transcritos de ADNmt en estado estacionario y la morfología mitocondrial. Además, la expresión de P193L a niveles endógenos no fue capaz de rescatar la señalización cGAS-STING mediada por la liberación de ADNmt. En general, informamos de una relación entre TOP1MT y la liberación de ADNmt que conduce a la activación de cGAS-STING. Además, demostramos que la variante P193L presenta una pérdida parcial de función que puede contribuir a la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes a través de la activación del sistema inmunitario innato mediada por cGAS-STING.

Malik, N., Ferreira, B.I., Hollstein, P.E., Curtis, S.D., Trefts, E., Weiser Novak, S., Yu, J., Gilson, R., Hellberg, K., Fang, L., Sheridan, A., Hah, N., Shadel, G.S., Manor, U., Shaw, R.J. Inducción de biogénesis lisosomal y mitocondrial por fosforilación de FNIP1 mediada por AMPK. (2023) Ciencia. 380(6642):eabj5559. DOI: 10.1126/science.abj5559

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Newman, L.E., Shadel, G.S. Liberación de ADN mitocondrial en la señalización inmune innata. (2023) Revisión Anual de Bioquímica. DOI: 10.1146/annurev-biochem-032620-104401

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Nassour, J., Aguiar, L.G., Correia, A., Schmidt, T., Mainz, L., Przetocka, S., Haggblom, C., Tadepalle, N., Williams, A., Shokhirev, M.N., Akincilar, S.C., Tergaonkar, V., Shadel, S., Karlseder, J. La señalización de telómero a mitocondria mediada por ZBP1 provoca una crisis replicativa (2023) Naturaleza. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05710-8

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2022

Cobo, I., Tanaka, T.N., Chandra Mangalhara, K., Lana, A., Yeang, C., Han, C., Schlachetzki, J., Challcombe, J., Fixsen, B.R., Sakai, M., Li, R.Z., Fields, H., Mokry, M., Tsai, R.G., Bejar, R., Prange, K., de Winther, M., Shadel, G.S., Glass, C.K. La ADN metiltransferasa 3 alfa y la TET metilcitosina dioxigenasa 2 restringen la señalización de interferón mediada por ADN mitocondrial en macrófagos. (2022) Inmunidad. DOI: 10.1016/j.immuni.2022.06.022

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Hancock-Cerutti, W., Wu, Z., Xu, P., Yadavalli , N., Leonzino, M., Tharkeshwar, A.K., Ferguson, S.M., Shadel, G.S., De Camilli, P. La proteína de transferencia de lípidos ER-lisosoma VPS13C/PARK23 previene la señalización STING aberrante dependiente de mtDNA (2022) Revista de Biología Celular. 221(7):e202106046. DOI: 10.1083/jcb.202106046

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Xian, H., Watari, K., Sanchez-Lopez, E., Offenberger, J., Onyuru, J., Sampath, H., Ying, W., Hoffman, H.M., Shadel, G.S., Karin, M. Fragmentos de ADN oxidados salen de las mitocondrias a través de canales dependientes de mPTP y VDAC para activar la señalización del inflamosoma NLRP3 y del interferón. (2022) Inmunidad. DOI: 10.1016/j.immuni.2022.06.007

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Hepokoski, M.L., Odish, M.F., Lam, M.T., Coufal, N.G., Rolfsen, M.L., Shadel, G.S., Moyzis, A.G., Sainz, A.G., Takiar, P.G., Patel, S., Leonard, A.J., Samandari, N., Hansen, E., Trescott, S., Nguyen, C., Jepsen, K., Cutter, G., Gillespie, M.N., Spragg, R.G., Sasik, R., Ix, J.H. La cuantificación absoluta del ADN mitocondrial en plasma mediante PCR digital en gotas marca la gravedad de la COVID-19 a lo largo del tiempo durante la admision en la unidad de cuidados intensivos. (2022) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. DOI: 10.1152/ajplung.00128.2022

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El aumento de las concentraciones plasmáticas de ADN mitocondrial se asocia con malos resultados en múltiples enfermedades críticas, incluida la COVID-19. Sin embargo, los métodos actuales de cuantificación del ADN mitocondrial libre en plasma requieren mucho tiempo y carecen de reproducibilidad. En este estudio, utilizamos la secuenciación de última generación para caracterizar el tamaño y la ubicación genómica del ADN mitocondrial circulante en pacientes críticos con COVID-19, con el fin de desarrollar un método sencillo y óptimo de cuantificación mediante PCR digital en gotas. La secuenciación reveló un gran porcentaje de fragmentos pequeños de ADN mitocondrial en plasma con una amplia variabilidad en la cobertura según la ubicación en el genoma. Identificamos sondas para los genes del ADN mitocondrial, citocromo B y NADH deshidrogenasa 1, en regiones de cobertura relativamente alta que se dirigen a secuencias pequeñas que otros métodos podrían pasar por alto. A continuación, se determinaron evaluaciones seriadas de las concentraciones absolutas de ADN mitocondrial en plasma de 20 pacientes en estado crítico con COVID-19 sin un paso de aislamiento de ADN. Las concentraciones de ADN mitocondrial el día de la inclusión aumentaron significativamente en los pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) moderado o grave en comparación con aquellos sin SDRA o con SDRA leve. Las comparaciones de las concentraciones de ADN mitocondrial a lo largo del tiempo entre los pacientes sin SDRA o con SDRA leve que sobrevivieron, los pacientes con SDRA moderado o grave que sobrevivieron y los que no sobrevivieron mostraron las concentraciones más altas en los pacientes con enfermedad más grave. La cuantificación absoluta del ADN mitocondrial mediante PCR digital en gotas es eficiente en términos de tiempo y reproducible; por lo tanto, proporcionamos una herramienta valiosa y una justificación para futuros estudios que evalúen el ADN mitocondrial como biomarcador en tiempo real para orientar la toma de decisiones clínicas en pacientes críticos con COVID-19.

2021

Shadel, G.S., Adams, P.D., Berggren, W.T., Diedrich, J.K., Diffenderfer, K.E., Gage, F.H., Hah, N., Hansen, M., Hetzer, M.W., Molina, A.J.A., Manor, U., Marek, K., O'Keefe, D.D., Pinto, A.F.M., Sacco, A., Sharpee, T.O., Shokriev, M.N., Zambetti, S. El Centro Nathan Shock de San Diego: abordando la heterogeneidad del envejecimiento. (2021) Gerociencia. DOI: 10.1007/s11357-021-00426-x

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Comprender los mecanismos básicos del envejecimiento ofrece grandes perspectivas para desarrollar intervenciones que prevengan o retrasen simultáneamente muchos deterioros y enfermedades relacionados con la edad, con el fin de prolongar la esperanza de vida saludable. Sin embargo, un importante factor de confusión en la investigación sobre el envejecimiento es la heterogeneidad del propio proceso de envejecimiento. A nivel del organismo, está claro que la edad cronológica no siempre predice la edad biológica ni la susceptibilidad a la fragilidad o la patología. Si bien la genética y el entorno son factores importantes que determinan las tasas variables de envejecimiento, surge una complejidad adicional debido a que los diferentes órganos, tejidos y tipos de células son intrínsecamente heterogéneos y presentan diferentes trayectorias de envejecimiento, ya sea de manera normal o en respuesta a las tensiones del proceso de envejecimiento (por ejemplo, la acumulación de daños). Abordar la heterogeneidad del envejecimiento requiere herramientas nuevas y especializadas (por ejemplo, análisis de células individuales, enfoques basados en la espectrometría de masas e imágenes avanzadas) para identificar nuevas firmas del envejecimiento en todas las escalas. A continuación, se necesitan enfoques computacionales de vanguardia para integrar estos conjuntos de datos dispares y dilucidar las interacciones en red entre los rasgos característicos conocidos del envejecimiento. También existe la necesidad de modelos mejorados de envejecimiento basados en células humanas para garantizar que los hallazgos de la investigación básica sean relevantes para el envejecimiento humano y las intervenciones para prolongar la vida saludable. El San Diego Nathan Shock Center (SD-NSC) brinda acceso a recursos científicos de vanguardia para facilitar el estudio de la heterogeneidad del envejecimiento en general y promover el uso de nuevos modelos de envejecimiento con células humanas. El centro también cuenta con un sólido Núcleo de Desarrollo de Investigación que financia proyectos piloto sobre la heterogeneidad del envejecimiento y organiza actividades de capacitación innovadoras, incluyendo talleres y un programa de tutoría personalizada, para ayudar a los investigadores nuevos en el campo del envejecimiento a tener éxito. Finalmente, el SD-NSC participa en actividades de divulgación para educar a la comunidad en general sobre la importancia de la investigación sobre el envejecimiento y promover la necesidad de la investigación en biología básica del envejecimiento en particular.

Wu, Z., Sainz, A.G., Shadel, G.S. ADN mitocondrial: centinela del estrés genotóxico celular. (2021) Tendencias en Ciencias Bioquímicas. DOI: 10.1016/j.tibs.2021.05.004

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Tadepalle, N., Shadel, G.S. El ARN informa de noticias de última hora desde las mitocondrias. (2021) Biología Celular Molecular. 81(9):1863-1865. DOI: 10.1016/j.molcel.2021.04.005

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Lei, Y., Zhang, J., Schiavon, C.R., He, M., Chen, L., Shen, H., Zhang, Y., Yin, Q., Cho, Y., Andrade, L., Shadel, G.S., Hepokoski, M., Lei, T., Wang, H., Zhang, J., Yuan, J.X., Malhotra, A., Manor, U., Wang, S., Yuan, Z.Y., Shyy, J.Y. La proteína espiga del SARS-CoV-2 afecta la función endotelial al reducir la expresión de ACE2. (2021) Investigación de la circulación. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318902

Schwartz, R.E., Shokhirev, M.N., Andrade, L.R., Gutkind, J.S., Iglesias-Bartolome, R., Shadel, G.S. Perspectivas sobre la senescencia de células epiteliales a partir del análisis transcriptómico y secretómico de queratinocitos orales humanos. (2021) Envejecimiento. 13. DOI: 10.18632/aging.202658

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Schiavon, C.R., Shadel, G.S., Mansión, U. Disminución de la movilidad mitocondrial en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. (2021) Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9:624823. DOI: 10.3389/fcell.2021.624823

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2020

Schiavon, C.R., Zhang, T., Zhao, B., Moore, A.S., Wales, P., Andrade, L.R., Wu, M., Sung, T.C., Dayn, Y., Feng, J.W., Quintero, O.A., Shadel, G.S., Grosse, R., Manor, U. La obtención de imágenes con cromocuerpos de actina revela la dinámica subcelular de la actina. (2020) Nature Methods. DOI: 10.1038/s41592-020-0926-5

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2019

Wu, Z., Oeck, S., West, A.P., Mangalhara, K.C., Sainz, A.G., Newman, L.E., Zhang, X.O., Wu, L., Yan, Q., Bosenberg, M., Liu, Y., Sulkowski, P.L., Tripple, V., Kaech, S.M., Glazer, P.M., Shadel, G.S. El estrés del ADN mitocondrial señaliza y protege el genoma nuclear. [Pubmed] (2019) Metabolismo de la naturaleza. 1(12):1209-1218. DOI: 10.1038/s42255-019-0150-8

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El genoma de los mamíferos está compuesto por ADN nuclear (ADNn), que se hereda de ambos progenitores, y ADN mitocondrial (ADNmt), que se hereda por vía materna y codifica proteínas esenciales necesarias para la fosforilación oxidativa. En la mayoría de los tipos celulares hay miles de copias del ADNmt circular, que son empaquetadas por TFAM en estructuras de orden superior llamadas nucleoides1. Las mitocondrias también son plataformas para la señalización antiviral2 y, debido a su origen bacteriano, el ADNmt y otros componentes mitocondriales desencadenan respuestas inmunitarias innatas y patologías inflamatorias. Anteriormente demostramos que la inestabilidad y la liberación citoplasmática del ADNmt activan la vía cGAS-STING-TBK1, lo que da lugar a la expresión de genes estimulados por interferón (ISG) que promueven la inmunidad antiviral4. Aquí, encontramos que el estrés persistente del ADNmt no se asocia con la señalización de NF-κB activada de forma basal ni con la expresión de genes de interferón, típicas de una respuesta antiviral aguda. En cambio, un subconjunto específico de ISG, que incluye , permanece activado por la forma no fosforilada de ISGF3 (U-ISGF3), la cual potencia el daño al ADN mitocondrial y las respuestas de reparación. En fibroblastos primarios y células cancerosas cultivadas, el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina causa daño y liberación de ADN mitocondrial, lo que conduce a la activación de ISG dependiente de cGAS-STING. Además, el estrés del ADNmt en células de melanoma de ratón con deficiencia de TFAM produce tumores que son más resistentes a la doxorrubicina. Finalmente, los ratones expuestos a radiación ionizante muestran respuestas mejoradas de reparación del ADNn en el bazo. Por lo tanto, proponemos que el daño y la posterior liberación del ADNmt provocan una respuesta de señalización protectora que potencia la reparación del ADNn en células y tejidos, lo que sugiere que el ADNmt es un centinela del estrés genotóxico.

Gale, M., Li, Y., Cao, J., Liu, Z.Z., Holmbeck, M.A., Zhang, M., Lang, S.M., Wu, L., Do Carmo, M., Gupta, S., Aoshima, K., DiGiovanna, M.P., Stern, D.F., Rimm, D.L., Shadel, G.S., Chen, X., Yan, Q. La resistencia adquirida a las terapias dirigidas a HER2 crea una vulnerabilidad a la inhibición de la ATP sintasa. (2019) Investigación del Cáncer. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3985

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Harel, M., Ortenberg, R., Varanasi, S.K., Mangalhara, K.C., Mardamshina, M., Markovits, E., Baruch, E.N., Tripple, V., Arama-Chayoth, M., Greenberg, E., Shenoy, A., Ayasun, R., Knafo, N., Xu, S., Anafi, L., Yanovich-Arad, G., Barnabas, G.D., Ashkenazi, S., Besser, M.J., Schachter, J., Bosenberg, M., Shadel, G.S., Barshack, I., Kaech, S.M., Markel, G., Geiger, T. Proteómica de la Respuesta del Melanoma a la Inmunoterapia Revela Dependencia Mitocondrial. (2019) Móvil. DOI: 10.1016/j.cell.2019.08.012

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2018

Mangalhara, K.C., Shadel, G.S. Un péptido derivado de la mitocondria ejerce la opción nuclear. (2018) Metabolismo Celular. 28(3):330-331. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.08.017

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Newman, L.E., Shadel, G.S. El vínculo Pink1/Parkin relaciona la inflamación, el estrés mitocondrial y la neurodegeneración. (2018) Revista de Biología Celular. 217(10):3327-3329. DOI: 10.1083/jcb.201808118

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Cox, C.S., McKay, S.E., Holmbeck, M.A., Christian, B.E., Scortea, A.C., Tsay, A.J., Newman, L.E., Shadel, G.S. Mitohormesis en ratones vía activación basal sostenida de la señalización mitocondrial y antioxidante. (2018) Metabolismo Celular. 28(5):776-786. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.07.011

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Wu, L., Cao, J., Cai, W.L., Lang, S.M., Horton, J.R., Jansen, D.J., Liu, Z.Z., Chen, J.F., Zhang, M., Mott, B.T., Pohida, K., Rai, G., Kales, S.C., Henderson, M.J., Hu, X., Jadhav, A., Maloney, D.J., Simeonov, A., Zhu, S., Iwasaki, A., Hall, M.D., Cheng, X., Shadel, G.S., Yan, Q. Las desmetilasas de histonas KDM5 reprimen la respuesta inmune mediante la supresión de STING. (2018) PLOS Biología. 16(8):e2006134. DOI: 10.1371/journal.pbio.2006134

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Zhang, Y., Lee, J.H., Paull, T.T., Gehrke, S., D'Alessandro, A., Dou, Q., Gladyshev, V.N., Schroeder, E.A., Steyl, S.K., Christian, B.E., Shadel, G.S. La detección redox mitocondrial por la quinasa ATM mantiene la capacidad antioxidante celular. (2018) Science Signaling. 11(538). DOI: 10.1126/scisignal.aaq0702

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Las mitocondrias son fundamentales para el metabolismo energético celular y la producción de ATP, y participan en la regulación de numerosos procesos celulares. Las mitocondrias producen especies reactivas del oxígeno (ROS), que no solo pueden dañar los componentes celulares, sino que también intervienen en la transducción de señales. La quinasa ATM, que presenta una mutación en la ataxia-telangiectasia (A-T), una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva, es un actor clave en la respuesta al daño del ADN nuclear. Sin embargo, la ATM también desempeña una función de detección redox mediada por la formación de dímeros unidos por puentes disulfuro dependientes de ROS. Descubrimos que el peróxido de hidrógeno derivado de las mitocondrias promovía la dimerización de la ATM. En las células HeLa, los dímeros de ATM se localizaron en el núcleo y fueron inhibidos por la proteína reguladora del redox tiorredoxina 1 (TRX1), lo que sugiere la existencia de un relevo de señalización de estrés mediado por ROS desde las mitocondrias al núcleo. La formación de dímeros de ATM no afectó su asociación con la cromatina en ausencia o presencia de daño al ADN nuclear, lo cual concuerda con la separación de sus funciones de señalización del redox y del daño al ADN. El análisis comparativo de células U2OS que expresaban ATM de tipo salvaje o el mutante C2991L deficiente en la detección redox reveló que una de las funciones de la detección redox de ATM es promover el flujo de glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato (PPP) al aumentar la abundancia y la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), incrementando así la capacidad antioxidante celular. La PPP produce la coenzima NADPH necesaria para una respuesta antioxidante robusta, incluida la regeneración de TRX1, lo que indica la existencia de un bucle de retroalimentación regulador en el que participan ATM y TRX1. Proponemos que la pérdida de la función de detección de ROS mitocondriales de ATM puede causar la acumulación de ROS celulares y estrés oxidativo en la A-T.

Kuszak, A.J., Espey, M.G., Falk, M.J., Holmbeck, M.A., Manfredi, G., Shadel, G.S., Vernon, H.J., Zolkipli-Cunningham, Z. Intervenciones nutricionales para deficiencias de la Fosforilación Oxidativa Mitocondrial (OXPHOS): Mecanismos y sistemas modelo. (2018) Revisión Anual de Patología. 13(163-191):163-191. DOI: 10.1146/annurev-pathol-020117-043644

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2017

West, A.P., Shadel, G.S. ADN mitocondrial en respuestas inmunitarias innatas y patología inflamatoria. (2017) Nature Reviews. Inmunología. 17(6):363-375. DOI: 10.1038/nri.2017.21

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Schweppe, D.K., Chavez, J.D., Lee, C.F., Caudal, A., Kruse, S.E., Stuppard, R., Marcinek, D.J., Shadel, G.S., Tian, R., Bruce, J.E. Interactoma de proteínas mitocondriales elucidado por espectrometría de masas con entrecruzamiento químico. (2017) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 114(7):1732-1737. DOI: 10.1073/pnas.1617220114

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2016

Oran, A.R., Adams, C.M., Zhang, X.Y., Gennaro, V.J., Pfeiffer, H.K., Mellert, H.S., Seidel, H.E., Mascioli, K., Kaplan, J., Gaballa, M.R., Shen, C., Rigoutsos, I., King, M.P., Cotney, J.L., Arnold, J.J., Sharma, S.D., Martinez-Outschoorn, U.E., Vakoc, C.R., Chodosh, L.A., Thompson, J.E., Bradner, J.E., Cameron, C.E., Shadel, G.S., Eischen, C.M., McMahon, S.B. El control multifocal de la expresión génica mitocondrial por MYC oncogénico proporciona posibles dianas terapéuticas en el cáncer. (2016) Oncotarget. 7(45):72395-72414. DOI: 10.18632/oncotarget.11718

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Kang, M.J., Shadel, G.S. Una perspectiva mitocondrial de la patogénesis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. (2016) Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias. 79(4):207-213. DOI: 10.4046/trd.2016.79.4.207

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Holmbeck, M.A., Shadel, G.S. Las mitocondrias brindan una solución 'compleja' a un problema bacteriano. (2016) Naturaleza Inmunológica. 17(9):1009-10. DOI: 10.1038/ni.3534

Nouws, J., Goswami, A.V., Bestwick, M., McCann, B.J., Surovtseva, Y.V., Shadel, G.S. La proteína ribosomal mitocondrial L12 es necesaria para la estabilidad de POLRMT y existe en dos formas generadas por proteólisis alternativa durante la importación. (2016) Revista de Química Biológica. 291(2):989-97. DOI: 10.1074/jbc.M115.689299

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2015

McKay, S.E., Yan, W., Nouws, J., Thormann, M.J., Raimundo, N., Khan, A., Santos-Sacchi, J., Song, L., Shadel, G.S. Patología Auditiva en un Modelo Transgénico de Ratón con mtTFB1 de Sordera Mitocondrial. (2015) Am. J. Pathol. 185(12):3132-40. DOI: 10.1016/j.ajpath.2015.08.014

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La mutación A1555G en el gen del ARN ribosómico 12S del ADN mitocondrial humano provoca sordera no sindrómica de transmisión materna, un caso extremo de patología mitocondrial específica de un tejido. Una cepa de ratones transgénicos que sobreexpresa de manera robusta la metiltransferasa del ARN ribosómico 12S mitocondrial TFB1M (ratones Tg-mtTFB1) presenta una pérdida auditiva progresiva que, según propusimos, modela aspectos de la patología relacionada con A1555G en humanos. Aunque nuestros estudios previos con ratones Tg-mtTFB1 implicaban la apoptosis en el ganglio espiral y la estría vascular debido a la activación mediada por especies reactivas de oxígeno mitocondrial de la AMP-quinasa (AMPK) y el factor de transcripción nuclear E2F1, no se había delineado la patología auditiva detallada. En este trabajo, mostramos que los ratones Tg-mtTFB1 presentan un potencial endococlear reducido, indicativo de una disfunción significativa de la estría vascular, pero sin signos evidentes de atrofia de la estría. También observamos una disminución de la amplitud del pico 1 de la respuesta auditiva del tronco encefálico y una latencia prolongada de la onda I, lo cual concuerda con la apoptosis de las neuronas del ganglio espiral. Aunque no se observó una pérdida importante de células ciliadas, hubo un deterioro leve de la electromotilidad dependiente del voltaje de las células ciliadas externas. Sobre la base de estos resultados, proponemos que estos eventos se combinan para producir el fenotipo de pérdida auditiva progresiva en ratones Tg-mtTFB1. Por último, la reducción genética de AMPK α1 revierte la pérdida auditiva en ratones Tg-mtTFB1, lo que confirma que la regulación al alza anómala de la señalización de AMPK promueve la patología auditiva observada. Se discute la relevancia de estos hallazgos para los pacientes humanos con A1555G y el valor terapéutico potencial de reducir la actividad de AMPK.

Camell, C.D., Nguyen, K.Y., Jurczak, M.J., Christian, B.E., Shulman, G.I., Shadel, G.S., Dixit, V.D. La síntesis de novo de ceramida específica de macrófagos es prescindible para la inflamación impulsada por el inflamasoma y la resistencia a la insulina en la obesidad. (2015) Revista de Química Biológica. 290(49):29402-13. DOI: 10.1074/jbc.M115.680199

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La sobrecarga de lípidos en la dieta y el exceso de calorías durante la obesidad constituyen un estado inflamatorio crónico de baja intensidad que se caracteriza por una capacidad reducida para metabolizar adecuadamente la glucosa o los lípidos. Los macrófagos desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del tejido adiposo, en parte mediante la regulación del metabolismo lipídico, la homeostasis energética y la remodelación tisular. Durante la obesidad inducida por una dieta alta en grasas, los macrófagos se activan por "señales de peligro" derivadas de los lípidos, como las ceramidas y el palmitato, y promueven la inflamación del tejido adiposo de una manera dependiente del inflamasoma Nlrp3. Dado que el destino metabólico de los ácidos grasos en los macrófagos no está del todo dilucidado, hemos planteado la hipótesis de que la síntesis de novo de ceramida, a través de la enzima limitante de la velocidad serina palmitoiltransferasa de cadena larga (Sptlc)-2, es necesaria para la activación del inflamasoma Nlrp3 impulsada por ácidos grasos saturados en los macrófagos. Aquí informamos que la sobreexpresión de catalasa dirigida a las mitocondrias, que se sabe que mitiga el estrés oxidativo, controla la activación del inflamasoma Nlrp3 inducida por la ceramida, pero no afecta la escisión de la caspasa-1 mediada por el ATP. Sorprendentemente, la deleción específica de Sptlc2 en las células mieloides no es necesaria para la activación del inflamasoma Nlrp3 impulsada por el palmitato. Además, la ablación de Sptlc2 en los macrófagos no afectó a la polarización de los macrófagos ni a la leucocitosis del tejido adiposo inducida por la obesidad. En consonancia con estos datos, la investigación de la resistencia a la insulina mediante clamps hiperinsulinémicos-euglucémicos no reveló diferencias significativas en ratones obesos que carecían del mecanismo de síntesis de novo de ceramida en los macrófagos. Estos datos sugieren que vías metabólicas alternativas controlan la síntesis de ceramida derivada de ácidos grasos en los macrófagos y la activación del inflamasoma Nlrp3 en la obesidad.

Shadel, G.S., Horvath, T.L. Señalización de ROS mitocondriales en la homeostasis orgánica. (2015) Móvil. 163(3):560-9. DOI: 10.1016/j.cell.2015.10.001

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Longo, V.D., Antebi, A., Bartke, A., Barzilai, N., Brown-Borg, H.M., Caruso, C., Curiel, T.J., de Cabo, R., Franceschi, C., Gems, D., Ingram, D.K., Johnson, T.E., Kennedy, B.K., Kenyon, C., Klein, S., Kopchick, J.J., Lepperdinger, G., Madeo, F., Mirisola, M.G., Mitchell, J.R., Passarino, G., Rudolph, K.L., Sedivy, J.M., Shadel, G.S., Sinclair, D.A., Spindler, S.R., Suh, Y., Vijg, J., Vinciguerra, M., Fontana, L. Intervenciones para retrasar el envejecimiento en humanos: ¿Estamos listos? (2015) Célula en Envejecimiento. 14(4):497-510. DOI: 10.1111/acel.12338

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El taller titulado 'Intervenciones para retrasar el envejecimiento en los seres humanos: ¿estamos preparados?' se celebró en Erice, Italia, del 8 al 13 de octubre de 2013, con el objetivo de reunir a los principales expertos en biología y genética del envejecimiento y alcanzar un consenso en torno al descubrimiento y desarrollo de intervenciones seguras para retrasar el envejecimiento y aumentar la esperanza de vida saludable en los seres humanos. Hubo consenso en que existen pruebas suficientes de que las intervenciones contra el envejecimiento retrasarán y prevendrán la aparición de muchas enfermedades crónicas en la edad adulta y la vejez. Se han identificado vías esenciales y han surgido enfoques conductuales, dietéticos y farmacológicos. Aunque se debatieron muchos genes diana y fármacos y no hubo un consenso completo sobre todas las intervenciones, los participantes seleccionaron un subconjunto de las estrategias más prometedoras que podrían probarse en humanos para evaluar sus efectos sobre la esperanza de vida saludable. Estas fueron: (i) intervenciones dietéticas que imitan la restricción alimentaria crónica (dietas que imitan el ayuno periódico, restricción proteica, etc.); (ii) fármacos que inhiben el eje de la hormona del crecimiento/IGF-I; (iii) fármacos que inhiben la vía mTOR-S6K; o (iv) fármacos que activan la AMPK o sirtuinas específicas. Estas elecciones se basaron en parte en evidencia consistente de los efectos a favor de la longevidad y la capacidad de estas intervenciones para prevenir o retrasar múltiples enfermedades relacionadas con la edad y mejorar la esperanza de vida saludable en organismos modelo simples y roedores, así como en su potencial para ser seguras y efectivas en la prolongación de la esperanza de vida saludable en humanos. Los autores de este manuscrito fueron ponentes y participantes invitados al taller. El siguiente resumen destaca los puntos principales abordados y las conclusiones de la reunión.

Kang, M.J., Yoon, C.M., Kim, B.H., Lee, C.M., Zhou, Y., Sauler, M., Homer, R., Dhamija, A., Boffa, D., West, A.P., Shadel, G.S., Ting, J.P., Tedrow, J.R., Kaminski, N., Kim, W.J., Lee, C.G., Oh, Y.M., Elias, J.A. Supresión de NLRX1 en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. (2015) Revista de Investigación Clínica. 125(6):2458-62. DOI: 10.1172/JCI71747

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2014

Rongvaux, A., Jackson, R., Harman, C.C., Li, T., West, A.P., de Zoete, M.R., Wu, Y., Yordy, B., Lakhani, S.A., Kuan, C.Y., Taniguchi, T., Shadel, G.S., Chen, Z.J., Iwasaki, A., Flavell, R.A. Las caspasas apoptóticas previenen la inducción de interferones tipo I por el ADN mitocondrial. (2014) Móvil. 159(7):1563-77. DOI: 10.1016/j.cell.2014.11.037

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Clayton, D.A., Shadel, G.S. Aislamiento de mitocondrias de células y tejidos. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.top074542. DOI: 10.1101/pdb.top074542

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Clayton, D.A., Shadel, G.S. Purificación de mitocondrias por centrifugación en gradiente de densidad en gradientes de sacarosa. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014 (10): pdb.prot080028. DOI: 10.1101/pdb.prot080028

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Clayton, D.A., Shadel, G.S. Aislamiento de mitocondrias de tejido animal. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080010. DOI: 10.1101/pdb.prot080010

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Clayton, D.A., Shadel, G.S. Aislamiento de mitocondrias de cultivos de células de tejido. (2014) Protocolos de Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080002. DOI: 10.1101/pdb.prot080002

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Nouws, J., Shadel, G.S. Microgestión de la traducción mitocondrial. (2014) Móvil. 158(3):477-8. DOI: 10.1016/j.cell.2014.07.010

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Shadel, G.S. Vive más tiempo en MARTE: un paradigma de levadura de señalización ROS adaptativa mitocondrial en el envejecimiento. (2014) Célula microbiana. 1(5):140-144. DOI: 10.15698/mic2014.05.143

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Mannam, P., Shinn, A.S., Srivastava, A., Neamu, R.F., Walker, W.E., Bohanon, M., Merkel, J., Kang, M.J., Dela Cruz, C.S., Ahasic, A.M., Pisani, M.A., Trentalange, M., West, A.P., Shadel, G.S., Elias, J. A., Lee, P. J. MKK3 regula la biogénesis mitocondrial y la mitofagia en la lesión pulmonar inducida por sepsis. (2014) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 306(7):L604-19. DOI: 10.1152/ajplung.00272.2013

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Christian, B.E., Shadel, G.S. Envejecimiento: es SIRTainly posible restaurar la disfunción mitocondrial. (2014) Biología Actual. 24(5):R206-8. DOI: 10.1016/j.cub.2014.01.027

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Schroeder, E.A., Shadel, G.S. La comunicación cruzada entre señales de estrés mitocondrial regula la vida útil cronológica de la levadura. (2014) Mech. Ageing Dev. 135:41-9. DOI: 10.1016/j.mad.2013.12.002

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Sharma, N.K., Lebedeva, M., Thomas, T., Kovalenko, O.A., Stumpf, J.D., Shadel, G.S., Santos, J.H. Defectos intrínsecos en la reparación del ADN mitocondrial en la Ataxia-Telangiectasia. (2014) Reparación del ADN. 13:22-31. DOI: 10.1016/j.dnarep.2013.11.002

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2013

Schroeder, E.A., Raimundo, N., Shadel, G.S. El silencio epigenético media la longevidad inducida por el estrés mitocondrial. (2013) Metabolismo Celular. 17(6):954-64. DOI: 10.1016/j.cmet.2013.04.003

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Bestwick, M.L., Shadel, G.S. Accesorizando la maquinaria de transcripción mitocondrial humana. (2013) Tendencias en Ciencias Bioquímicas. 38(6):283-91. DOI: 10.1016/j.tibs.2013.03.006

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Surovtseva, Y.V., Shadel, G.S. Papel independiente de la transcripción para la ARN polimerasa mitocondrial humana en la biogénesis del ribosoma mitocondrial. (2013) Investigación de Ácidos Nucleicos. 41(4):2479-88. DOI: 10.1093/nar/gks1447

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2012

Ocampo, A., Liu, J., Schroeder, E.A., Shadel, G.S., Barrientos, A. Los umbrales respiratorios mitocondriales regulan la vida útil cronológica de la levadura y su extensión por restricción calórica. (2012) Metabolismo Celular. 16(1):55-67. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.05.013

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Longo, V.D., Shadel, G.S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Envejecimiento replicativo y cronológico en Saccharomyces cerevisiae. (2012) Metabolismo Celular. 16(1):18-31. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.06.002

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Lodeiro, M.F., Uchida, A., Bestwick, M., Moustafa, I.M., Arnold, J.J., Shadel, G.S., Cameron, C.E. La transcripción del segundo promotor de la hebra pesada del ADN mitocondrial humano está reprimida in vitro por el factor de transcripción A. (2012) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 109(17):6513-8. DOI: 10.1073/pnas.1118710109

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Los estudios celulares respaldan la existencia de dos promotores en la cadena pesada del ADN mitocondrial: el promotor 1 de la cadena pesada (HSP1) y el HSP2. Sin embargo, la transcripción a partir del HSP2 solo se ha descrito una vez en un sistema libre de células, y nunca cuando se han utilizado proteínas recombinantes. En este trabajo, documentamos la transcripción a partir del HSP2 utilizando un sistema in vitro de composición definida. Una plantilla de oligonucleótidos que representaba las posiciones 596-685 del ADNmt fue suficiente para observar la transcripción por parte de la ARN polimerasa mitocondrial humana (POLRMT), que dependía absolutamente del factor de transcripción mitocondrial B2 (TFB2M). La transcripción dependiente de POLRMT/TFB2M fue inhibida por concentraciones del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) estequiométricas con la plantilla de transcripción, una condición que activa la transcripción desde el promotor de la cadena ligera (LSP) in vitro. Los dominios de TFAM necesarios para la activación del LSP también fueron necesarios para la represión de HSP2, mientras que otras proteínas de unión al ADNmt no lograron alterar la producción transcripcional. Los sitios de unión para TFAM se localizaron a ambos lados del sitio de inicio de la transcripción de HSP2, lo que sugiere que la unión de TFAM interfiere con la unión de POLRMT y/o TFB2M. En consonancia con un modelo de unión competitiva para la represión de HSP2 por TFAM, el impacto de la concentración de TFAM en la transcripción de HSP2 se redujo al elevar las concentraciones de POLRMT y TFB2M. En el contexto de nuestros estudios previos sobre LSP y HSP1, ahora queda claro que existen tres promotores en el ADNmt humano. Cada promotor tiene un requisito único y/o una respuesta al nivel de TFAM presente, lo que implica una complejidad mucho mayor en la regulación de la transcripción mitocondrial de los mamíferos de lo que se reconocía hasta la fecha.

Schroeder, E.A., Shadel, G.S. El combustible mitocondrial alternativo extiende la vida útil. (2012) Metabolismo Celular. 15(4):417-8. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.03.011

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Raimundo, N., Song, L., Shutt, T.E., McKay, S.E., Cotney, J., Guan, M.X., Gilliland, T.C., Hohuan, D., Santos-Sacchi, J., Shadel, G.S. El estrés mitocondrial activa la señalización apoptótica dependiente de E2F1 para causar sordera. (2012) Móvil. 148(4):716-26. DOI: 10.1016/j.cell.2011.12.027

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Woo, D.K., Green, P.D., Santos, J.H., D'Souza, A.D., Walther, Z., Martin, W.D., Christian, B.E., Chandel, N.S., Shadel, G.S. La inestabilidad del genoma mitocondrial y las ERO mejoran la tumorigénesis intestinal en ratones APC(Min/+). (2012) Am. J. Pathol. 180(1):24-31. DOI: 10.1016/j.ajpath.2011.10.003

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Desde hace tiempo se han documentado alteraciones en la fosforilación oxidativa mitocondrial en los tumores. Otros tipos de disfunción mitocondrial, como la alteración en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la apoptosis, también pueden contribuir a la tumorigénesis y a los fenotipos del cáncer. Además, se han observado mutaciones y alteraciones en las cantidades de ADN mitocondrial (ADNmt) en las células cancerosas. Sin embargo, aún no se ha determinado en gran medida cómo la inestabilidad del ADNmt por sí misma contribuye al cáncer. El factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) es necesario para la expresión y el mantenimiento del ADNmt. Los ratones con deleción heterocigótica de Tfam (Tfam(+/-)) muestran una leve disminución del ADNmt, pero no presentan fenotipos evidentes. Demostramos que las células y los tejidos de ratones Tfam(+/-) no solo poseen menos ADNmt, sino que también presentan un mayor daño oxidativo en el ADNmt. El cruce de ratones Tfam(+/-) con el modelo de cáncer de ratón de neoplasia intestinal múltiple por poliposis adenomatosa coli (APC(Min/+)) reveló que la inestabilidad del ADNmt aumenta el número y el crecimiento de los tumores en el intestino delgado. Esto no fue resultado de una potenciación de la señalización Wnt/β-catenina, sino que parece implicar una propensión a una mayor producción de ROS mitocondriales. La participación directa de las ROS mitocondriales en la tumorigénesis intestinal se demostró al cruzar ratones APC(Min/+) con aquellos que tienen catalasa dirigida a las mitocondrias, lo que dio lugar a una reducción significativa de la tumorigénesis en el colon. Por lo tanto, la inestabilidad del genoma mitocondrial y las ROS potencian la tumorigénesis intestinal, y los ratones Tfam(+/-) constituyen un modelo relevante para abordar el papel de la inestabilidad del ADNmt en estados patológicos en los que está implicada la disfunción mitocondrial, como el cáncer, la neurodegeneración y el envejecimiento.

Malarkey, C.S., Bestwick, M., Kuhlwilm, J.E., Shadel, G.S., Churchill, M.E. La activación transcripcional por el factor A de transcripción mitocondrial implica una distorsión preferencial del ADN promotor. (2012) Investigación de Ácidos Nucleicos. 40(2):614-24. DOI: 10.1093/nar/gkr787

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2011

Liu, L., Sanosaka, M., Lei, S., Bestwick, M.L., Frey, J.H., Surovtseva, Y.V., Shadel, G.S., Cooper, M.P. La proteína LRP130 remodela las mitocondrias y estimula la oxidación de ácidos grasos. (2011) Revista de Química Biológica. 286(48):41253-64. DOI: 10.1074/jbc.M111.276121

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Surovtseva, Y.V., Shutt, T.E., Cotney, J., Cimen, H., Chen, S.Y., Koc, E.C., Shadel, G.S. La proteína ribosomal mitocondrial L12 se asocia selectivamente con la ARN polimerasa mitocondrial humana para activar la transcripción. (2011) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 108(44):17921-6. DOI: 10.1073/pnas.1108852108

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La transcripción basal del ADN mitocondrial humano (ADNmt) in vitro requiere la ARN polimerasa POLRMT, de una sola subunidad y relacionada con los bacteriófagos, y el factor de transcripción h-mtTFB2. Este sistema de dos componentes es activado de forma diferenciada en los promotores del ADNmt por el factor de transcripción mitocondrial humano A (h-mtTFA). La proteína ribosómica mitocondrial L7/L12 (MRPL12) se une directamente a la POLRMT, pero se desconoce si lo hace en el contexto del ribosoma o como una proteína "libre" en la matriz. Además, la evidencia existente de que MRPL12 activa la transcripción mitocondrial proviene de estudios de sobreexpresión en células cultivadas y experimentos de transcripción con lisados mitocondriales crudos, lo que impide atribuir efectos directos de MRPL12 sobre la transcripción. Aquí informamos que la depleción de MRPL12 de las células HeLa mediante shRNA da como resultado una disminución de los niveles en estado estacionario de los transcritos mitocondriales, lo cual no se explica por cambios en la estabilidad del ARN. También mostramos que existe un reservorio "libre" significativo de MRPL12 en las mitocondrias humanas no asociado a los ribosomas. La MRPL12 "libre" se une selectivamente a la POLRMT in vivo en un complejo distinto de los que contienen h-mtTFB2. Finalmente, utilizando un sistema de transcripción mitocondrial totalmente recombinante, demostramos que la MRPL12 estimula la transcripción dependiente e independiente del promotor directamente in vitro. Basándonos en estos resultados, proponemos que, cuando no está asociado a los ribosomas, el MRPL12 tiene una segunda función en la transcripción, actuando quizás para facilitar la transición de la iniciación a la elongación. Especulamos que este es un mecanismo para coordinar la biogénesis de los ribosomas mitocondriales y la transcripción en las mitocondrias humanas, donde la transcripción de los ARN ribosómicos a partir del ADN mitocondrial presumiblemente necesita ajustarse de acuerdo con la tasa de importación y ensamblaje de las MRP codificadas por el núcleo en los ribosomas.

Baysal, B.E., McKay, S.E., Kim, Y.J., Zhang, Z., Alila, L., Willett-Brozick, J.E., Pacak, K., Kim, T.H., Shadel, G.S. Impronta genómica en un elemento de frontera adyacente al locus SDHD. (2011) Genética Molecular Humana. 20(22):4452-61. DOI: 10.1093/hmg/ddr376

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Raimundo, N., Baysal, B.E., Shadel, G.S. Revisando el ciclo de TCA: señalización para la formación de tumores. (2011) Tendencias en Medicina Molecular. 17(11):641-9. DOI: 10.1016/j.molmed.2011.06.001

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Pan, Y., Schroeder, E.A., Ocampo, A., Barrientos, A., Shadel, G.S. Regulación de la longevidad cronológica de la levadura por TORC1 a través de la señalización mitocondrial adaptativa de ROS. (2011) Metabolismo Celular. 13(6):668-78. DOI: 10.1016/j.cmet.2011.03.018

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West, A.P., Shadel, G.S., Ghosh, S. Mitocondrias en las respuestas inmunes innatas. (2011) Nature Reviews. Inmunología. 11(6):389-402. DOI: 10.1038/nri2975

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Chatenay-Lapointe, M., Shadel, G.S. Represión de la traducción mitocondrial, la respiración y un gen regulado por el ciclo metabólico, SLF1, por la proteína de la familia Pumilio de levadura Puf3p. (2011) PLOS One. 6(5):e20441. DOI: 10.1371/journal.pone.0020441

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La síntesis y el ensamblaje del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) requieren genes ubicados tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial, pero aún no se comprende del todo cómo se coordina la expresión génica entre estos dos compartimentos. Un nivel de control se lleva a cabo a través de la expresión regulada de proteínas ribosómicas mitocondriales y otros factores necesarios para la traducción mitocondrial y el ensamblaje de OXPHOS, todos ellos productos de genes nucleares que posteriormente se importan a las mitocondrias. Curiosamente, este grupo de genes en la levadura en gemación tiene en común un elemento 3'-UTR al que se une la proteína de la familia Pumilio, Puf3p, y que se regula de manera coordinada en muchas condiciones, incluso durante el ciclo metabólico de la levadura. Se han atribuido múltiples funciones a Puf3p, entre ellas promover la degradación del ARNm, localizar transcritos mitocondriales codificados por el núcleo en la membrana mitocondrial externa y facilitar las interacciones entre las mitocondrias y el citoesqueleto, así como la motilidad. Aquí mostramos que Puf3p tiene un efecto represor general sobre la abundancia, la traducción y la respiración de la OXPHOS mitocondrial que no implica cambios en la biogénesis mitocondrial general y que es en gran medida independiente de la señalización TORC1-mitocondrial. También identificamos el factor de traducción citoplasmático Slf1p como un gen regulado por el ciclo metabólico de la levadura que es reprimido por Puf3p a nivel postranscripcional y que, cuando se sobreexpresa, promueve la respiración y la prolongación de la vida cronológica de la levadura. En conjunto, estos resultados deberían facilitar futuros estudios sobre cuál de las muchas funciones de Puf3p es más relevante para la regulación de la expresión génica mitocondrial y el papel de la comunicación nuclear-mitocondrial en el envejecimiento y la longevidad.

West, A.P., Brodsky, I.E., Rahner, C., Woo, D.K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M.C., Choi, Y., Shadel, G.S., Ghosh, S. La señalización TLR aumenta la actividad bactericida de los macrófagos a través de las ROS mitocondriales. (2011) Naturaleza. 472(7344):476-80. DOI: 10.1038/nature09973

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Las especies reactivas del oxígeno (ROS) son componentes esenciales de la respuesta inmunitaria innata contra las bacterias intracelulares, y se cree que los fagocitos profesionales generan ROS principalmente a través del sistema de NADPH oxidasa de los fagosomas. Sin embargo, estudios recientes han sugerido que las ROS mitocondriales (mROS) también contribuyen a la actividad bactericida de los macrófagos de ratón, aunque los mecanismos que vinculan la señalización inmunitaria innata con las mitocondrias para la generación de mROS siguen sin estar claros. Aquí demostramos que la activación de un subconjunto de receptores Toll-like (TLR1, TLR2 y TLR4) da lugar al reclutamiento de mitocondrias a los fagosomas de los macrófagos y aumenta la producción de mROS. Esta respuesta implica la translocación de un adaptador de señalización de TLR, el factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF6), a las mitocondrias, donde se une a la proteína ECSIT (intermedio de señalización conservado evolutivamente en las vías de Toll), que está implicada en el ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial. La interacción con TRAF6 conduce a la ubiquitinación de ECSIT y a su enriquecimiento en la periferia mitocondrial, lo que da lugar a una mayor generación de ROS mitocondriales y celulares. Los macrófagos con niveles reducidos de ECSIT y TRAF6 presentan niveles disminuidos de ROS inducidos por TLR y ven significativamente afectada su capacidad para eliminar bacterias intracelulares. Además, la reducción de los niveles de ROS mitocondriales (mROS) en los macrófagos mediante la expresión de catalasa en las mitocondrias da lugar a una destrucción bacteriana defectuosa, lo que confirma el papel de los mROS en la actividad bactericida. Estos resultados revelan una nueva vía que vincula la señalización del sistema inmunitario innato con las mitocondrias, implican a los mROS como un componente importante de las respuestas antibacterianas y consolidan aún más a las mitocondrias como centros de señalización del sistema inmunitario innato.

Shutt, T.E., Bestwick, M., Shadel, G.S. El complejo de iniciación de la transcripción mitocondrial humana: Solo se necesitan dos para bailar. (2011) Transcripción. 2(2):55-59. DOI: 10.4161/trns.2.2.14296

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Woo, D.K., Shadel, G.S. Las señales de estrés mitocondrial revisan una vieja teoría sobre el envejecimiento. (2011) Móvil. 144(1):11-2. DOI: 10.1016/j.cell.2010.12.023

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2010

Lee, H.Y., Choi, C.S., Birkenfeld, A.L., Alves, T.C., Jornayvaz, F.R., Jurczak, M.J., Zhang, D., Woo, D.K., Shadel, G.S., Ladiges, W., Rabinovitch, P.S., Santos, J.H., Petersen, K.F., Samuel, V.T., Shulman, G.I. La expresión dirigida de catalasa a las mitocondrias previene las reducciones asociadas a la edad en la función mitocondrial y la resistencia a la insulina. (2010) Metabolismo Celular. 12(6):668-74. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.004

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Chatenay-Lapointe, M., Shadel, G.S. Las mitocondrias estresadas se enojan. (2010) Metabolismo Celular. 12(6):559-60. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.018

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Shutt, T.E., Lodeiro, M.F., Cotney, J., Cameron, C.E., Shadel, G.S. El aparato mitocondrial de transcripción humana es un sistema de dos componentes regulado in vitro. (2010) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 107(27):12133-8. DOI: 10.1073/pnas.0910581107

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Actualmente se considera que el aparato de transcripción mitocondrial humano básico es un sistema obligatorio de tres componentes formado por la ARN polimerasa mitocondrial relacionada con el bacteriófago T7, el factor de transcripción relacionado con la metiltransferasa del ARN ribosómico (h-mtTFB2) y el factor de transcripción y empaquetamiento del ADN del grupo de alta movilidad (h-mtTFA/TFAM). Utilizando un sistema de transcripción mitocondrial humano recombinante fiel a partir de Escherichia coli, demostramos que la iniciación específica a partir de los promotores del ADNmt, LSP y HSP1, solo requiere la ARN polimerasa mitocondrial y h-mtTFB2 in vitro. Cuando se añade h-mtTFA a estos componentes basales, LSP muestra un umbral de activación mucho más bajo y una respuesta de mayor amplitud que HSP1. Además, cuando LSP y HSP1 se encuentran juntos en la misma plantilla de transcripción, se potencia la transcripción independiente de h-mtTFA desde HSP1 y la transcripción dependiente de h-mtTFA desde ambos promotores, y se requiere una mayor concentración de h-mtTFA para estimular HSP1. Los experimentos de competencia entre promotores revelaron que, además de que LSP compite con los componentes de transcripción alejándolos de HSP1, hay señales cis-activas adicionales involucradas en estos aspectos de la regulación del promotor. Basándonos en estos resultados, especulamos que el sistema de transcripción mitocondrial humano podría haber evolucionado para regular de manera diferencial el inicio de la transcripción y la replicación del ADNmt iniciada por la transcripción en respuesta a la cantidad de h-mtTFA asociada a los nucleoides, lo que podría comenzar a explicar la heterogeneidad de la estructura y actividad de los nucleoides in vivo. Además, este estudio arroja nueva luz sobre la evolución de los componentes de la transcripción mitocondrial al demostrar que el sistema humano es un sistema regulado de dos componentes in vitro y, por lo tanto, más parecido al de la levadura en gemación de lo que se pensaba anteriormente.

Shutt, T.E., Shadel, G.S. Un compendio de la maquinaria de expresión génica mitocondrial humana con vínculos a enfermedades. (2010) Mutagénesis Ambiental y Molecular. 51(5):360-79. DOI: 10.1002/em.20571

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2009

Pawar, V., Jingjing, L., Patel, N., Kaur, N., Doetsch, P.W., Shadel, G.S., Zhang, H., Siede, W. Fosforilación de la quinasa punto de control en respuesta al daño endógeno de ADN oxidativo en Saccharomyces cerevisiae en fase estacionaria deficiente en reparación. (2009) Mech. Ageing Dev. 130(8):501-8. DOI: 10.1016/j.mad.2009.06.002

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Shadel, G.S., Pan, Y. Regulación multifacética de las mitocondrias por TOR. (2009) Ciclo celular. 8(14):2143. DOI: 10.4161/cc.8.14.9117

Cotney, J., McKay, S.E., Shadel, G.S. La elucidación de las funciones separadas pero colaborativas de los factores de transcripción mitocondrial humanos B1 y B2 relacionados con la ARN ribosomal metiltransferasa en la biogénesis mitocondrial revela una nueva perspectiva sobre el apareamiento. (2009) Genética Molecular Humana. 18(14):2670-82. DOI: 10.1093/hmg/ddp208

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Griffiths, L. M., Doudican, N. A., Shadel, G.S., Doetsch, P.W. Daño oxidativo y mutagénesis del ADN mitocondrial en Saccharomyces cerevisiae. (2009) Métodos en Biología Molecular. 554:267-86. DOI: 10.1007/978-1-59745-521-3_17

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Las mutaciones del ADN mitocondrial humano (ADNmt) se han relacionado con trastornos neuromusculares de transmisión materna y están implicadas en enfermedades más comunes, como el cáncer, la diabetes y la enfermedad de Parkinson. Las mutaciones en el ADNmt también se acumulan con la edad y, por lo tanto, se cree que contribuyen al envejecimiento y a las patologías relacionadas con la edad. Ubicado dentro de la matriz mitocondrial, el ADNmt codifica varias de las proteínas involucradas en la producción de ATP a través del proceso de fosforilación oxidativa, que implica el flujo de electrones de alta energía a través de la cadena de transporte de electrones (CTE). Debido a su proximidad a la CTE, el ADNmt es altamente vulnerable al daño oxidativo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el peróxido de hidrógeno, el superóxido y los radicales hidroxilo, que son producidos constantemente por este sistema. Por lo tanto, es importante poder medir el daño oxidativo del ADNmt en condiciones fisiológicas normales y durante el estrés ambiental o asociado a enfermedades. La levadura en gemación, Saccharomyces cerevisiae, es un sistema modelo sencillo e informativo para estudiar dicho daño oxidativo del ADNmt, ya que es un eucariota unicelular anaerobio facultativo cuya viabilidad depende condicionalmente de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Aquí describimos métodos para cuantificar el daño oxidativo del ADNmt y la mutagénesis en S. cerevisiae, varios de los cuales podrían aplicarse al desarrollo de ensayos similares en células y tejidos de mamíferos. Estos métodos incluyen la medición del número de mutaciones puntuales que se producen en el ADNmt con el ensayo de resistencia a la eritromicina, la cuantificación de la cantidad de daño oxidativo del ADN utilizando un ensayo Southern blot modificado, y la medición de la integridad del ADNmt con el ensayo de "inducción petite".

Crouser, E.D., Shao, G., Julian, M.W., Macre, J.E., Shadel, G.S., Tridandapani, S., Huang, Q., Wewers, M.D. La activación de monocitos por células necróticas es promovida por proteínas mitocondriales y receptores de formil péptidos. (2009) Medicina de cuidados intensivos. 37(6):2000-9. DOI: 10.1097/CCM.0b013e3181a001ae

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Suissa, S., Wang, Z., Poole, J., Wittkopp, S., Feder, J., Shutt, T.E., Wallace, D.C., Shadel, G.S., Mishmar, D. Las variantes genéticas antiguas del ADNmt modulan la transcripción y replicación del ADNmt. (2009) PLOS Genetics. 5(5):e1000474. DOI: 10.1371/journal.pgen.1000474

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Aunque las consecuencias funcionales de los antecedentes genéticos del ADN mitocondrial (ADNmt) —haplotipos y haplogrupos— han quedado demostradas tanto en estudios de asociación con enfermedades como en experimentos con cultivos celulares, no está claro cuáles de las mutaciones dentro del haplogrupo tienen implicaciones funcionales y cuáles son "polizones evolutivos silenciosos". Nos propusimos estudiar la funcionalidad de las mutaciones que definen los haplogrupos dentro de la región reguladora de la transcripción/replicación del mtDNA mediante transcripción in vitro, planteando la hipótesis de que las mutaciones que definen los haplogrupos y que ocurren dentro de los motivos reguladores del mtDNA podrían afectar estos procesos. Por lo tanto, analizamos más de 2500 mtDNAs humanos completos, representativos de todas las principales poblaciones del mundo, en busca de variación natural en los sitios de unión a proteínas establecidos experimentalmente y en las regiones reguladoras, que comprenden un total de 241 pb en cada mtDNA. Nuestro cribado reveló 77 de 241 sitios que mostraban mutaciones puntuales que podían dividirse en cambios no fijos (57/77, 74%) y cambios definidores de haplogrupos o subhaplogrupos (es decir, cambios fijos en la población, 20/77, 26%). La variante que define el haplogrupo J caucásico (C295T) aumentó la unión de TFAM (ensayo de desplazamiento de movilidad eléctrica) y la capacidad de transcripción in vitro de la cadena L, especialmente de un transcrito más corto que se mapea inmediatamente aguas arriba del bloque de secuencia conservada 1 (CSB1), una región asociada con el inicio de la replicación del ADNmt por ARN. En consonancia con este hallazgo, los cibridos (es decir, células que comparten el mismo fondo genético nuclear pero difieren en sus fondos de ADNmt) portadores del haplogrupo J de ADNmt presentaron un aumento >2 veces mayor en el número de copias de ADNmt, en comparación con los cibridos que contenían el haplogrupo H, sin diferencias aparentes en los niveles de estado estacionario de los transcritos codificados por el ADNmt. Por lo tanto, una mutación en la región reguladora del haplogrupo J afecta la replicación o la estabilidad del ADNmt, lo que podría explicar en parte el impacto fenotípico de este haplogrupo. Nuestro análisis demuestra así, por primera vez, el impacto funcional de mutaciones específicas en la región de control que definen los haplogrupos del ADNmt, allanando el camino para evaluar la funcionalidad de variantes genéticas tanto fijas como no fijas en el genoma mitocondrial.

Lebedeva, M.A., Eaton, J.S., Shadel, G.S. La pérdida de p53 causa depleción del ADN mitocondrial y alteración de la homeostasis de las especies reactivas de oxígeno mitocondrial. (2009) Bioquímica y Biofísica Acta. 1787(5):328-34. DOI: 10.1016/j.bbabio.2009.01.004

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Raimundo, N., Shadel, G.S. Una visión mitocondrial "radical" de la patología relacionada con la autofagia. (2009) Envejecimiento. 1(4):354-6. DOI: 10.18632/aging.100037

Tal, M.C., Sasai, M., Lee, H.K., Yordy, B., Shadel, G.S., Iwasaki, A. La ausencia de autofagia resulta en una amplificación dependiente de especies reactivas de oxígeno de la señalización RLR. (2009) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 106(8):2770-5. DOI: 10.1073/pnas.0807694106

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Pan, Y., Shadel, G.S. La extensión de la vida cronológica mediante la reducción de la señalización TOR requiere la regulación a la baja de Sch9p y implica un aumento de la densidad del complejo OXPHOS mitocondrial. (2009) Envejecimiento. 1131-45. DOI: 10.18632/aging.100016

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La vía de la proteína diana de la rapamicina (TOR), sensible a los nutrientes, parece desempeñar una función conservada en la regulación de la esperanza de vida. Esta red de señalización es compleja y tiene numerosas repercusiones fisiológicas posteriores, por lo que los mecanismos que subyacen a sus efectos relacionados con el envejecimiento aún no se han dilucidado por completo. Anteriormente demostramos que la señalización reducida de TOR (cepas intor1Delta) prolonga la esperanza de vida cronológica (CLS) de la levadura al aumentar el consumo de oxígeno mitocondrial, en parte, mediante la regulación al alza de la traducción de las subunidades de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) codificadas por el ADN mitocondrial. Aquí hemos examinado con mayor detalle cómo la señalización de TOR influye en la función mitocondrial y la CLS, así como el papel de la quinasa Sch9p en la vía TOR-mitocondria. Al igual que ocurre con el consumo de oxígeno, la traducción mitocondrial se eleva en las cepas tor1Delta solo durante el crecimiento activo y en los puntos de crecimiento de la fase estacionaria temprana. Esto va acompañado de un aumento correspondiente en la abundancia de subunidades de OXPHOS codificadas tanto por el ADNmt como por el núcleo por masa mitocondrial. Sin embargo, este aumento en la densidad del complejo OXPHOS no se asocia con un mayor número de mitocondrias por célula ni con un aumento del ATP celular, y conduce a una disminución general del potencial de membrana, lo que sugiere que la señalización de TOR podría influir en el desacoplamiento respiratorio. Finalmente, documentamos que la quinasa Sch9p es un efector clave aguas abajo de la OXPHOS, las ROS y la CLS en la vía TOR-mitocondria. En conjunto, nuestros resultados demuestran que la señalización de TOR tiene un papel global en la regulación de la dinámica y la función del proteoma mitocondrial, lo cual es importante para su papel en el envejecimiento, y proporcionan evidencia convincente de la participación de un efecto de "preacondicionamiento mitocondrial" en la determinación de la CLS.

2008

Shadel, G.S. En la salvaje frontera de las enfermedades mitocondriales y el envejecimiento. (2008) Métodos. 46(4):239-40. DOI: 10.1016/j.ymeth.2008.10.027

Bonawitz, N.D., Chatenay-Lapointe, M., Wearn, C.M., Shadel, G.S. La expresión de la proteína mitocondrial codificada por rDNA Tar1p está rigurosamente controlada y responde diferencialmente a la demanda respiratoria mitocondrial y a la disfunción. (2008) Genética actual. 54(2):83-94. DOI: 10.1007/s00294-008-0203-0

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Shadel, G.S. Expresión y mantenimiento del ADN mitocondrial: nuevas perspectivas en la patología de enfermedades humanas. (2008) Am. J. Pathol. 172(6):1445-56. DOI: 10.2353/ajpath.2008.071163

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Schleicher, M., Shepherd, B. R., Suárez, Y., Fernández-Hernando, C., Yu, J., Pan, Y., Acevedo, L. M., Shadel, G.S., Sessa, W.C. Prohibitin-1 mantiene la capacidad angiogénica de las células endoteliales al regular la función mitocondrial y la senescencia. (2008) Revista de Biología Celular. 180(1):101-12. DOI: 10.1083/jcb.200706072

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2007

Eaton, J.S., Lin, Z.P., Sartorelli, A.C., Bonawitz, N.D., Shadel, G.S. La quinasa mutada de ataxia-telangiectasia regula la ribonucleótido reductasa y la homeostasis mitocondrial. (2007) Revista de Investigación Clínica. 117(9):2723-34. DOI: 10.1172/JCI31604

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Lebedeva, M.A., Shadel, G.S. Los cambios en el número de copias del ADN mitocondrial impulsados por el ciclo celular y la ribonucleótido reductasa influyen en la herencia del ADN mitocondrial sin comprometer la expresión génica mitocondrial. (2007) Ciclo celular. 6(16):2048-57. DOI: 10.4161/cc.6.16.4572

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La mayoría de los eucariotas mantienen múltiples copias de ADN mitocondrial, que oscilan entre 20 y 50 en la levadura y llegan a alcanzar las 10 000 en las células de mamíferos. El genoma mitocondrial codifica subunidades esenciales de la cadena respiratoria, pero el número de moléculas de ADN mitocondrial parece ser superior al necesario para mantener una respiración adecuada, como lo demuestra el "efecto umbral" observado en las enfermedades mitocondriales. Por lo tanto, otras presiones selectivas aparentemente han contribuido al mantenimiento universal de múltiples moléculas de ADNmt por célula. Aquí analizamos la interacción entre las dos vías propuestas para regular el número de copias de ADNmt en Saccharomyces cerevisiae, y la necesidad de un número normal de copias de ADNmt para la expresión génica mitocondrial, la respiración y la herencia. Aportamos la primera evidencia directa de que la regulación al alza del ADNmt puede lograrse aumentando la actividad de la ribonucleótido reductasa (RNR) mediante la desrepresión de la transcripción del gen nuclear de la RNR o la eliminación de la regulación alostérica de retroalimentación. El análisis de cepas mutantes de rad53 también reveló una regulación al alza del número de copias de ADNmt independiente de la resultante de una actividad elevada de la RNR. Presentamos evidencia de que un ciclo celular prolongado permite la acumulación de ADNmt en estas cepas. El análisis de múltiples cepas con aumento o disminución del ADNmt reveló que existen mecanismos para prevenir cambios significativos en la expresión génica mitocondrial y la respiración ante alteraciones de aproximadamente el doble en el número de copias de ADNmt. Sin embargo, el agotamiento del ADNmt en cepas nulas de abf2 conduce a una herencia defectuosa del ADNmt que se rescata parcialmente mediante la reposición de ADNmt a través de la sobreexpresión de RNR1. Estos resultados indican que una de las funciones de las múltiples copias de ADNmt es garantizar la herencia óptima del ADNmt durante la división celular.

Bonawitz, N.D., Shadel, G.S. Repensando la teoría mitocondrial del envejecimiento: el papel de la expresión génica mitocondrial en la determinación de la longevidad. (2007) Ciclo celular. 6(13):1574-8. DOI: 10.4161/cc.6.13.4457

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Cotney, J., Wang, Z., Shadel, G.S. Abundancia relativa del sistema de transcripción mitocondrial humano y roles distintos para h-mtTFB1 y h-mtTFB2 en la biogénesis y expresión de genes mitocondriales. (2007) Investigación de Ácidos Nucleicos. 35(12):4042-54. DOI: 10.1093/nar/gkm424

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Bonawitz, N.D., Chatenay-Lapointe, M., Pan, Y., Shadel, G.S. La señalización reducida de TOR extiende la vida útil cronológica a través de un aumento de la respiración y la regulación positiva de la expresión de genes mitocondriales. (2007) Metabolismo Celular. 5(4):265-77. DOI: 10.1016/j.cmet.2007.02.009

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Wang, Z., Cotney, J., Shadel, G.S. La proteína ribosómica mitocondrial humana MRPL12 interactúa directamente con la ARN polimerasa mitocondrial para modular la expresión génica mitocondrial. (2007) Revista de Química Biológica. 282(17):12610-8. DOI: 10.1074/jbc.M700461200

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El mecanismo central de transcripción mitocondrial humano está compuesto por una ARN polimerasa de subunidad única relacionada con los bacteriófagos, POLRMT; la proteína de unión al ADN del grupo de alta movilidad h-mtTFA/TFAM; y dos proteínas coactivadoras de la transcripción, h-mtTFB1 y h-mtTFB2, que también poseen actividad metiltransferasa de ARN ribosómico. La recapitulación de la iniciación específica de la transcripción in vitro puede lograrse mediante un complejo de POL-RMT, h-mtTFA y h-mtTFB1 o h-mtTFB2. Sin embargo, la naturaleza de los complejos de transcripción mitocondrial in vivo y la posible participación de proteínas adicionales en el proceso de transcripción en las mitocondrias humanas no se han investigado a fondo. En Saccharomyces cerevisiae, la transcripción y la traducción están físicamente acopladas mediante la formación de un complejo multiproteico nucleado por la unión de Nam1p al dominio amino-terminal de la ARN polimerasa mitocondrial (Rpo41p). Este paradigma del sistema modelo nos llevó a buscar proteínas que interactúen con POLRMT para regular la expresión génica mitocondrial en humanos. Utilizando una estrategia de captura por afinidad para identificar proteínas de unión a POL-RMT, identificamos la proteína ribosómica mitocondrial L7/L12 (MRPL12) como una proteína en extractos mitocondriales de HeLa que interactúa específicamente con POLRMT in vitro. La MRPL12 recombinante purificada se une a POLRMT y estimula la actividad de transcripción mitocondrial in vitro, lo que demuestra que esta interacción es tanto directa como funcional. Por último, en las células HeLa que sobreexpresan MRPL12 marcada con el epítopo FLAG, se observan niveles aumentados en estado estacionario de transcritos codificados por el ADNmt y se pueden co-inmunoprecipitar complejos MRPL12-POLRMT, lo que proporciona una fuerte evidencia de que esta interacción potencia la transcripción mitocondrial o la estabilidad del ARN in vivo. Especulamos que la interacción de MRPL12 con POLRMT probablemente forme parte de un nuevo mecanismo regulador que coordina la transcripción mitocondrial con la traducción y/o la biogénesis ribosómica durante la expresión génica mitocondrial humana.

Zhang, H., Luo, Y., Zhang, W., He, Y., Dai, S., Zhang, R., Huang, Y., Bernatchez, P., Giordano, F.J., Shadel, G., Sessa, W.C., Min, W. La expresión endotelial específica de la tioredoxina mitocondrial mejora la función de las células endoteliales y reduce las lesiones ateroscleróticas. (2007) Am. J. Pathol. 170(3):1108-20. DOI: 10.2353/ajpath.2007.060960

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Lin, Z.P., Belcourt, M.F., Carbone, R., Eaton, J.S., Penketh, P.G., Shadel, G.S., Cory, J.G., Sartorelli, A.C. El exceso de subunidades R2 de la ribonucleótido reductasa coordina el punto de control de la fase S para facilitar la reparación del daño al ADN y la recuperación del estrés de replicación. (2007) Bioquím. Farmacol. 73(6):760-72. DOI: 10.1016/j.bcp.2006.11.014

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La ribonucleótido reductasa (RNR), compuesta por las subunidades R1 y R2, cataliza un paso clave en la síntesis de trifosfatos de desoxirribonucleósidos (dNTP) para la replicación y reparación del ADN. La subunidad R2 se regula de manera específica según el ciclo celular para garantizar una síntesis oportuna del ADN y está regulada negativamente por p53 en respuesta al daño en el ADN. En este trabajo demostramos que la presencia de un exceso de subunidades R2 en las células de cáncer de colon humano HCT-116 p53(-/-) protege contra el daño al ADN y el estrés de replicación. La supresión estable mediada por ARNip (>80%) del exceso de subunidades R2 no tiene efecto sobre el crecimiento proliferativo, pero da lugar a una mayor acumulación de gamma-H2Ax y a una recuperación retardada de las lesiones en el ADN infligidas por la exposición al cisplatino y a la triapina. Esta inducción acentuada de gamma-H2Ax en las células con silenciación de R2 se atribuye a una capacidad reducida para reparar el ADN dañado y superar el bloqueo de la replicación. La falta de un exceso de subunidades R2 aumenta, en consecuencia, la activación de chk1 y la degradación de cdc25A, lo que provoca una progresión celular impedida a través de la fase S y una apoptosis aumentada en respuesta al daño en el ADN y al estrés de replicación. Por el contrario, el nivel de subunidades R1 parece ser limitante, ya que el agotamiento de la subunidad R1 activa directamente el punto de control de la fase S debido al estrés de replicación asociado con la actividad RNR deteriorada. Estos hallazgos sugieren que el exceso de subunidades R2 facilita la reparación del daño en el ADN y la recuperación del estrés de replicación mediante la coordinación con el punto de control de la fase S en ausencia de p53 funcional. Por lo tanto, el nivel de la subunidad R2 constituye un determinante importante de la quimiosensibilidad de las células cancerosas y sirve como un objetivo potencial para mejorar la terapia basada en el daño en el ADN.

Shutt, T.E., Shadel, G.S. Ampliando el interactoma mitocondrial. (2007) Biología del Genoma. 8(2):203. DOI: 10.1186/gb-2007-8-2-203

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2006

Bonawitz, N.D., Clayton, D.A., Shadel, G.S. Iniciación y más allá: funciones múltiples de la maquinaria de transcripción mitocondrial humana. (2006) Biología Celular Molecular. 24(6):813-25. DOI: 10.1016/j.molcel.2006.11.024

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Cotney, J., Shadel, G.S. Evidencia de un evento temprano de duplicación génica en la evolución de la familia del factor B de transcripción mitocondrial y el mantenimiento de la actividad de la metiltransferasa de ARNr en mtTFB1 y mtTFB2 humanos. (2006) J. Mol. Evol. 63(5):707-17. DOI: 10.1007/s00239-006-0075-1

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La mayoría de los metazoos poseen dos genes nucleares que codifican ortólogos del bien caracterizado factor de transcripción mitocondrial B de Saccharomyces cerevisiae (sc-mtTFB). Esta clase de factores de transcripción es homóloga a la familia bacteriana KsgA de metiltransferasas de ARN ribosómico (ARNr), que en Escherichia coli dimetila residuos de adenina adyacentes en un bucle en forma de tallo del ARNr 16S. Esta modificación postranscripcional se conserva en la mayoría de los ARN ribosómicos citoplasmáticos y mitocondriales de los metazoos. El factor de transcripción mitocondrial B1 de Homo sapiens (h-mtTFB1) posee esta actividad enzimática, lo que lo implica como una proteína de doble función involucrada en la transcripción y traducción mitocondrial. Aquí demostramos que h-mtTFB2 también tiene actividad de metiltransferasa de ARN ribosómico, pero es una enzima menos eficiente que h-mtTFB1. Por el contrario, sc-mtTFB no tiene actividad detectable de metiltransferasa de ARN ribosómico, lo que se correlaciona con la ausencia de la modificación correspondiente en el ARN ribosómico mitocondrial de la levadura en gemación. Basándonos en estos resultados, y en los informes de que mtTFB1 y mtTFB2 de Drosophila melanogaster no tienen funciones que se superpongan por completo, proponemos un modelo para la regulación del ADNmt humano que toma en cuenta que h-mtTFB1 y h-mtTFB2 probablemente tengan funciones parcialmente redundantes como factor de transcripción y metiltransferasa de ARN ribosómico. Por último, los análisis filogenéticos de esta familia de proteínas sugieren firmemente que la presencia de dos homólogos de mtTFB en los metazoos es el resultado de un evento de duplicación génica que ocurrió en una etapa temprana de la evolución eucariótica, antes de la divergencia de los hongos y los metazoos. Este modelo sugiere que, tras el evento de duplicación génica, se produjeron presiones selectivas diferenciales sobre las actividades de metiltransferasa de ARN ribosómico y de factor de transcripción de los genes mtTFB, con casos extremos que culminaron en la pérdida de uno de los genes paralógicos en ciertas especies.

Bonawitz, N.D., Rodeheffer, M.S., Shadel, G.S. La expresión defectuosa de genes mitocondriales da como resultado la inhibición de la respiración mediada por especies reactivas de oxígeno y la reducción de la vida útil de la levadura. (2006) Biología Molecular y Celular. 26(13):4818-29. DOI: 10.1128/MCB.02360-05

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2005

O'Rourke, T.W., Doudican, N.A., Zhang, H., Eaton, J.S., Doetsch, P.W., Shadel, G.S. Participación diferencial de las helicasas de ADN relacionadas Pif1p y Rrm3p en la mut. (2005) Gén. 354:86-92. DOI: 10.1016/j.gene.2005.03.031

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A excepción de la reparación por escisión de bases, las vías y los mecanismos conservados que mantienen la estabilidad del genoma mitocondrial siguen sin estar bien definidos en su mayor parte. En la levadura en gemación, Saccharomyces cerevisiae, Pif1p es una helicasa de ADN única que se localiza tanto en el núcleo como en las mitocondrias, donde participa en el mantenimiento de la integridad del ADN. Anteriormente, dilucidamos un papel de Pif1p en la resistencia al daño oxidativo del ADN mitocondrial que parece ser distinto de su función postulada en la recombinación del ADN mitocondrial. Las cepas que carecen de Pif1p (pif1Delta) presentan una mayor tasa de formación de mutantes petite (un indicador de inestabilidad del ADN mitocondrial) y una mutagénesis puntual elevada del ADN mitocondrial. Aquí mostramos que la deleción del gen RRM3, que codifica una helicasa de ADN estrechamente relacionada con Pif1p, rescata significativamente el fenotipo de inducción de petite de una cepa pif1Delta. Sin embargo, la supresión de este fenotipo no fue acompañada por una disminución correspondiente en la mutagénesis puntual del ADNmt. En cambio, la deleción de RRM3 por sí sola resultó en un aumento de la mutagénesis puntual del ADNmt que fue sinérgico con el causado por una mutación pif1Delta. Además, descubrimos que la sobreexpresión de RNR1, que codifica una subunidad grande de la ribonucleótido reductasa (RNR), rescató el fenotipo de inducción de petite de una mutación pif1Delta en una medida similar a la deleción de RRM3. Esto, junto con nuestro hallazgo de que la proteína quinasa Rad53p se fosforila en la cepa doble mutante rrm3Delta pif1Delta, nos lleva a concluir que un mecanismo por el cual la deleción de RRM3 influye en la estabilidad del ADNmt es mediante la modulación de las reservas de trifosfato de desoxinucleósido mitocondrial. Proponemos que esto se logra mediante la señalización a través de la vía conservada del punto de control de la fase S Mec1/Rad53 para inducir la expresión y la actividad de RNR. En conjunto, nuestros resultados definen una nueva función de Rrm3p en la función mitocondrial e indican que Pif1p y Rrm3p influyen en un proceso (o procesos) común(es) involucrado(s) en la replicación, reparación o estabilidad del ADNmt.

Shadel, G.S. El ADN mitocondrial, la aconitasa lo 'envuelve'. (2005) Tendencias en Ciencias Bioquímicas. 30(6):294-6. DOI: 10.1016/j.tibs.2005.04.007

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Doudican, N.A., Song, B., Shadel, G.S., Doetsch, P.W. El daño oxidativo del ADN causa inestabilidad genómica mitocondrial en Saccharomyces cerevisiae. (2005) Biología Molecular y Celular. 25(12):5196-204. DOI: 10.1128/MCB.25.12.5196-5204.2005

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Las mitocondrias contienen su propio genoma, cuya integridad es necesaria para el metabolismo energético celular normal. Las especies reactivas del oxígeno (ROS) producidas por la respiración mitocondrial normal pueden dañar las macromoléculas celulares, incluido el ADN mitocondrial (ADNmt), y se han relacionado con enfermedades degenerativas, el cáncer y el envejecimiento. Desarrollamos estrategias para aumentar el estrés oxidativo mitocondrial mediante la exposición a antimicina y H₂O₂ o utilizando mutantes que carecen de la superóxido dismutasa mitocondrial (sod2Delta). Se realizaron experimentos con cepas con deficiencias en la reparación mitocondrial por escisión de bases (ntg1Delta) y en la resistencia al daño oxidativo (pif1Delta) con el fin de delinear la relación entre estas vías. Observamos una mayor producción de ROS, lo que resultó en un aumento directo del daño oxidativo al ADNmt y de la mutagénesis. Los mutantes con deficiencias de reparación expuestos a condiciones de estrés oxidativo mostraron una profunda inestabilidad genómica. La eliminación de Ntg1p y Pif1p dio lugar a una alteración sinérgica de la competencia respiratoria tras la exposición a antimicina y H₂O₂. La integridad genómica mitocondrial se vio sustancialmente comprometida en las cepas ntg1Delta pif1Delta sod2Delta, ya que estas células exhiben una pérdida total de ADNmt. Una cepa estable con defecto respiratorio, que poseía un complemento normal de vías de resistencia al daño del ADNmt, mostró una pérdida completa del ADNmt tras la exposición a la antimycina y al H₂O₂. Esta pérdida se pudo prevenir mediante la sobreexpresión de Sod2p. Estos resultados proporcionan evidencia directa de que el daño oxidativo del ADNmt puede ser un factor importante en la inestabilidad genómica mitocondrial y demuestran la cooperación de Ntg1p y Pif1p para resistir la introducción de lesiones en el genoma mitocondrial.

Taylor, S.D., Zhang, H., Eaton, J.S., Rodeheffer, M.S., Lebedeva, M.A., O'rourke, T.W., Siede, W., Shadel, G.S. La vía conservada de punto de control nuclear Mec1/Rad53 regula el número de copias del ADN mitocondrial en *Saccharomyces cerevisiae*. (2005) Biología molecular de la célula. 16(6):3010-8. DOI: 10.1091/mbc.e05-01-0053

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Se desconoce en gran medida cómo se determina y modula el número de copias del ADN mitocondrial (ADNmt) en función de las necesidades celulares. Nuestras investigaciones previas sobre las helicasas de ADN relacionadas Pif1p y Rrm3p revelaron el papel que desempeñan estos factores y la vía conservada del punto de control nuclear Mec1/Rad53 en la mutagénesis y la estabilidad del ADNmt en Saccharomyces cerevisiae. En este trabajo, demostramos otra función novedosa de esta vía en la regulación del número de copias del ADNmt. La deleción de RRM3 o SML1, o la sobreexpresión de RNR1, que recapitula la activación de la vía Mec1/Rad53, dio lugar a un aumento de aproximadamente el doble en el contenido de ADNmt en comparación con las cepas de levadura de tipo salvaje correspondientes. Además, la deleción de RRM3 o SML1 rescató por completo la disminución de aproximadamente 50% del ADNmt observada en una cepa nula de pif1. Además, se demostró que la deleción de SML1 era epistática tanto a una mutación nula de rad53 como a una de rrm3, lo que sitúa a estos tres genes en la misma vía genética de regulación del número de copias de ADNmt. Por último, el aumento del número de copias de ADNmt a través de la vía Mec1/Rad53 podría producirse independientemente de Abf2p, una proteína de unión al ADNmt que, al igual que sus homólogos metazoarios, está implicada en el control del número de copias de ADNmt. En conjunto, estos resultados indican que la señalización a través de la vía Mec1/Rad53 aumenta el número de copias de ADNmt al alterar las reservas de desoxirribonucleósidos trifosfatos mediante la actividad de la ribonucleótido reductasa. Esto constituye la primera vinculación de una vía de señalización conservada con la regulación del número de copias del genoma mitocondrial y sugiere que las vías homólogas en los seres humanos podrían regular de manera similar el contenido de ADNmt en condiciones fisiológicas.

2004

Shadel, G.S. Acoplamiento de la maquinaria de transcripción mitocondrial a enfermedades humanas. (2004) Tendencias en Genética. 20(10):513-9. DOI: 10.1016/j.tig.2004.08.005

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Shadel, G.S. Un factor de transcripción mitocondrial de doble función elimina la sordera. (2004) Genética Molecular y Metabolismo. 82(1):1-3. DOI: 10.1016/j.ymgme.2004.02.003

2003

McCulloch, V., Shadel, G.S. El factor de transcripción B1 mitocondrial humano interactúa con la región de activación C-terminal de h-mtTFA y estimula la transcripción independientemente de su actividad ARN metiltransferasa. (2003) Biología Molecular y Celular. 23(16):5816-24.

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Rodeheffer, M.S., Shadel, G.S. Múltiples interacciones que involucran el dominio amino-terminal de la ARN polimerasa mitocondrial de levadura determinan la eficiencia de la síntesis de proteínas mitocondriales. (2003) Revista de Química Biológica. 278(20):18695-701. DOI: 10.1074/jbc.M301399200

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Seidel-Rogol, B.L., McCulloch, V., Shadel, G.S. El factor B1 de transcripción mitocondrial humano metila el ARN ribosomal en un bucle de tallo conservado. (2003) Nature Genetics. 33(1):23-4. DOI: 10.1038/ng1064

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2002

Coelho, P.S., Bryan, A.C., Kumar, A., Shadel, G.S., Snyder, M. Una nueva proteína mitocondrial, Tar1p, está codificada en la hebra antisentido del ADNr nuclear de 25S. (2002) Genes y Desarrollo. 16(21):2755-60. DOI: 10.1101/gad.1035002

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O'Rourke, T.W., Doudican, N.A., Mackereth, M.D., Doetsch, P.W., Shadel, G.S. La disfunción mitocondrial debido al daño oxidativo del ADN mitocondrial se reduce a través de acciones cooperativas de diversas proteínas. (2002) Biología Molecular y Celular. 22(12):4086-93.

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El genoma mitocondrial es un objetivo importante de los agentes genotóxicos exógenos y endógenos; sin embargo, los factores que determinan esta susceptibilidad y las vías disponibles para resistir el daño al ADN mitocondrial (ADNmt) no están bien caracterizados. En este trabajo informamos que el daño oxidativo al ADNmt es mayor en cepas que carecen de Ntg1p, lo que proporciona la primera evidencia funcional directa de que esta enzima de reparación por escisión de bases, localizada en la mitocondria, actúa protegiendo el ADNmt. Sin embargo, las cepas nulas de ntg1 no mostraron un fenotipo de deficiencia en la respiración mitocondrial (petite), lo que sugiere que el daño al mtDNA se contrarresta mediante la acción cooperativa de múltiples vías de resistencia al daño. Las mutaciones nulas en ABF2 o PIF1, dos genes implicados en el mantenimiento y la recombinación del mtDNA, muestran un fenotipo synthetic-petite en combinación con mutaciones nulas de ntg1, lo cual va acompañado de una mayor mutagénesis puntual del mtDNA en las cepas dobles mutantes correspondientes. Este fenotipo fue parcialmente rescatado por el ácido malónico, lo que indica que las especies reactivas de oxígeno generadas por la cadena de transporte de electrones contribuyen a la disfunción mitocondrial en las cepas abf2 Delta. Por el contrario, cuando se inactivaron otros dos genes implicados en la recombinación del ADNmt, CCE1 y NUC1, no se observó un fenotipo sintético-petite marcado, lo que sugiere que los efectos mediados por Abf2p y Pif1p se deben a actividades novedosas de estas proteínas distintas de la recombinación. Estos resultados documentan la existencia de mecanismos independientes de la recombinación, además de la reparación por escisión de bases, para hacer frente al daño oxidativo del ADNmt en Saccharomyces cerevisiae. Es probable que dichos sistemas sean relevantes para los que operan en las células humanas, donde la recombinación del ADNmt es menos frecuente, lo que valida a la levadura como un sistema modelo en el que estudiar estas importantes cuestiones.

Seidel-Rogol, B.L., Shadel, G.S. Modulación de la transcripción mitocondrial en respuesta al agotamiento y reabastecimiento del ADNmt en células HeLa. (2002) Investigación de Ácidos Nucleicos. 30(9):1929-34.

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Se analizaron las concentraciones en estado de equilibrio de los transcritos mitocondriales y las proteínas de transcripción durante el agotamiento del ADN mitocondrial y su posterior reposición, con el fin de comprender mejor la regulación de la expresión génica mitocondrial humana. Tal y como se ha documentado anteriormente, se observó que las células HeLa a las que se les había agotado el ADN mitocondrial mediante un tratamiento con bromuro de etidio (EB) presentaban niveles reducidos en estado de equilibrio del factor de transcripción mitocondrial h-mtTFA. Cuando las células parcialmente desprovistas de ADNmt se cultivaron en ausencia de EB, el h-mtTFA se recuperó hasta niveles normales a un ritmo significativamente más lento que el ADNmt. La ARN polimerasa mitocondrial humana exhibió un perfil de agotamiento-reposición similar, lo que sugiere que el mecanismo de transcripción mitocondrial se regula de manera coordinada en respuesta a los cambios en el número de copias de ADNmt. Se detectaron transcritos mitocondriales recién sintetizados al inicio de la fase de recuperación, a pesar de que el ADNmt, el h-mtTFA y la h-mtARN polimerasa se habían agotado simultáneamente. Aunque con retraso respecto al ADNmt, las cantidades de h-mtTFA y h-mtARN polimerasa aumentaron bruscamente durante las etapas posteriores de la fase de recuperación, lo cual estuvo acompañado de tasas aceleradas de transcripción y replicación del ADNmt. En conjunto, estos datos indican que, cuando el número de copias de ADNmt es bajo, resulta beneficioso prevenir la acumulación de proteínas de transcripción mitocondrial. Además, la h-mtTFA y la h-mtARN polimerasa están normalmente presentes en exceso respecto a la cantidad requerida para la transcripción, o bien su actividad se regula al alza para garantizar la expresión continua y la replicación dependiente de la transcripción del genoma mitocondrial durante los estados de agotamiento de ADNmt.

McCulloch, V., Seidel-Rogol, B.L., Shadel, G.S. Un factor de transcripción mitocondrial humano está relacionado con ARN adenina metiltransferasas y se une a la S-adenosilmetionina. (2002) Biología Molecular y Celular. 22(4):1116-25.

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Bryan, A.C., Rodeheffer, M.S., Wearn, C.M., Shadel, G.S. Sls1p es un regulador unido a membrana de procesos acoplados a la transcripción involucrados en la expresión génica mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae. (2002) Genética. 160(1):75-82.

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2001

Shadel, G.S., Seidel-Rogol, B.L. Ensayos de diagnóstico para defectos en la replicación y transcripción del ADN mitocondrial en levaduras y humanos. (2001) Métodos en Biología Celular. 80:465-79. DOI: 10.1016/S0091-679X(06)80023-3

Seidel-Rogol, B.L., Shadel, G.S. Ensayos de diagnóstico para defectos en la replicación y transcripción del ADN mitocondrial en células de levadura y humanas. (2001) Métodos en Biología Celular. 65:413-27. DOI: 10.1016/s0091-679x(01)65024-6

Rodeheffer, M.S., Boone, B.E., Bryan, A.C., Shadel, G.S. Nam1p, una proteína involucrada en el procesamiento y la traducción del ARN, está acoplada a la transcripción a través de una interacción con la ARN polimerasa mitocondrial de levadura. (2001) Revista de Química Biológica. 276(11):8616-22. DOI: 10.1074/jbc.M009901200

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2000

Devine, J.H., Shadel, G.S. Ensayo de actividad autoinductora con cepas sensoras de Escherichia coli luminiscente que albergan un regulón lux de Vibrio fischeri modificado. (2000) Metodología enzimológica. 305:279-87. DOI: 10.1016/s0076-6879(00)05494-x

Shadel, G.S., Buckenmeyer, G.A., Clayton, D.A., Schmitt, M.E. Análisis mutacional del componente de ARN de la RNasa MRP de Saccharomyces cerevisiae revela fenotipos nucleares distintos. (2000) Gén. 245(1):175-84. DOI: 10.1016/s0378-1119(00)00013-5

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1999

Shadel, G.S. Levadura como modelo para la replicación del ADN mitocondrial humano. (1999) American Journal of Human Genetics. 65(5):1230-7. DOI: 10.1086/302630

Wang, Y., Shadel, G.S. La estabilidad del genoma mitocondrial requiere un dominio amino-terminal de la ARN polimerasa mitocondrial de levadura. (1999) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 96(14):8046-51. DOI: 10.1073/pnas.96.14.8046

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1997

Shadel, G.S., Clayton, D.A. Mantenimiento del ADN mitocondrial en vertebrados. (1997) Revisión Anual de Bioquímica. 66:409-35. DOI: 10.1146/annurev.biochem.66.1.409

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1996

Sitnikov, D.M., Shadel, G.S., Baldwin, T.O. Las mutantes del activador transcripcional LuxR independientes de autoinductores exhiben efectos diferenciales en los dos promotores lux de Vibrio fischeri. (1996) Genética Molecular y General. 252(5):622-5. DOI: 10.1007/bf02172408

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La proteína LuxR es un activador transcripcional que, junto con una pequeña molécula difusible denominada autoinductor [N-(3-oxohexanoil)-L-homo-serina lactona], constituye el principal nivel de regulación de los genes de bioluminiscencia en Vibrio fischeri. LuxR, en presencia del autoinductor, activa la transcripción del grupo de genes luxICDABEG y autorregula tanto positiva como negativamente la transcripción del gen luxR, orientado de forma divergente, activando la transcripción a bajos niveles de autoinductor y reprimiendo la síntesis a altas concentraciones de autoinductor. Se han caracterizado siete mutantes puntuales de LuxR que activan la transcripción de lux en V. fischeri en ausencia de autoinductor (LuxR*). Las proteínas LuxR* activaron la transcripción de los genes de bioluminiscencia a niveles entre 1,5 y 40 veces superiores a los alcanzados por LuxR de tipo salvaje sin autoinductor. Todas las mutantes LuxR* conservaron la capacidad de respuesta al autoinductor. Sin embargo, en cada caso, el grado de estimulación en respuesta al autoinductor fue menor que el observado para LuxR de tipo salvaje. Las proteínas LuxR* conservaron la necesidad del autoinductor para la autorregulación del gen luxR. Proponemos que la proteína LuxR existe en dos conformaciones: una forma inactiva y una forma activa que predomina en presencia del autoinductor. Las mutaciones de LuxR* parecen desplazar la distribución de equilibrio de estas dos formas para aumentar la cantidad de la forma activa en ausencia del autoinductor, mientras que el autoinductor aún puede convertir las especies inactivas en activas. Los efectos diferenciales de las proteínas LuxR* en los dos promotores lux sugieren que LuxR estimula la transcripción de PluxR mediante un mecanismo diferente al utilizado en el promotor PluxI, lo que implica que la unión de LuxR a su sitio de unión, que se sabe que es necesaria para la activación transcripcional, podría no ser suficiente.

Shadel, G.S., Clayton, D.A. Aislamiento y caracterización de homólogos del factor A de transcripción mitocondrial de vertebrados. (1996) Metodología enzimológica. 264:149-58. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64016-6

Shadel, G.S., Clayton, D.A. Mapeo de promotores en la región de bucle de desplazamiento del ADN mitocondrial de vertebrados. (1996) Metodología enzimológica. 264:139-48. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64015-4

Carrodeguas, J.A., Yun, S., Shadel, G.S., Clayton, D.A., Bogenhagen, D.F. Conservación funcional de mtTFB de levadura a pesar de una extensa divergencia de secuencias. (1996) Expr. Génica. 6(4):219-30.

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1995

Dairaghi, D.J., Shadel, G.S., Clayton, D.A. El factor A de transcripción mitocondrial humana y la integridad del espaciado del promotor son necesarios para la iniciación de la transcripción. (1995) Bioquímica y Biofísica Acta. 1271(1):127-34. DOI: 10.1016/0925-4439(95)00019-z

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Dairaghi, D.J., Shadel, G.S., Clayton, D.A. La adición de una cola carboxilo-terminal de 29 residuos convierte una proteína simple que contiene una caja HMG en un activador transcripcional. (1995) Revista de Biología Molecular. 249(1):11-28. DOI: 10.1006/jmbi.1995.9889

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Shadel, G.S., Clayton, D.A. Un factor de transcripción mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae, sc-mtTFB, comparte características con los factores sigma, pero es funcionalmente distinto. (1995) Biología Molecular y Celular. 15(4):2101-8. DOI: 10.1128/mcb.15.4.2101

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1993

Shadel, G.S., Clayton, D.A. Iniciación de la transcripción mitocondrial. Variación y conservación. (1993) Revista de Química Biológica. 268(22):16083-6.

1992

Shadel, G.S., Baldwin, T.O. Autorregulación positiva del gen luxR de Vibrio fischeri. LuxR y el autoinductor activan la transcripción de luxR independiente y dependiente del complejo proteína activadora de genes catabólicos del AMPc. (1992) Revista de Química Biológica. 267(11):7696-702.

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La proteína LuxR es un activador transcripcional que participa en la regulación de los genes necesarios para la bioluminiscencia (lux) en la bacteria marina Vibrio fischeri. La transcripción de los dos operones lux orientados de forma divergente (luxR y luxICDABEG) es activada por LuxR en presencia de un inductor difusible (autoinductor). La transcripción del gen luxR está sujeta tanto a autorregulación positiva como negativa, así como a la activación por el complejo proteína activadora de genes cAMP-catabolito (cAMP-CAP). Se estudió la transcripción de luxR utilizando tanto la luminiscencia in vivo como reportero como el análisis de extensión de cebadores del ARNm sintetizado in vivo. La mutación del sitio de unión de CAP de lux dio lugar a una reducción de la luminiscencia del reportero y a la pérdida completa de la autorregulación positiva de luxR. La autorregulación positiva se restableció si se proporcionaba luxR en trans, lo que demostró que LuxR y el autoinductor activan la transcripción de luxR en ausencia de cAMP-CAP. Mediante el análisis de extensión de cebadores, se demostraron tres sitios de iniciación de la transcripción de luxR; la iniciación en dos de estos sitios requirió cAMP-CAP. La cantidad de los tres transcritos aumentó en presencia de LuxR y autoinductor cuando se utilizó un plásmido con un sitio de unión a CAP de tipo salvaje. No se observó la iniciación en los sitios dependientes de cAMP-CAP a partir de un plásmido con un sitio de unión a CAP mutado, ni en presencia ni en ausencia de autoinductor, incluso con luxR suministrado en trans. En cambio, con luxR suministrado en trans, la iniciación en el sitio de iniciación independiente de cAMP-CAP fue estimulada específicamente por LuxR y el autoinductor. Así, en el curso de la autorregulación positiva, la proteína LuxR activa la transcripción desde dos promotores de luxR mediante un mecanismo dependiente de AMPc-CAP y desde un tercer promotor mediante un mecanismo independiente de AMPc-CAP.

Shadel, G.S., Baldwin, T.O. Identificación de un elemento regulador ubicado a distancia en el gen luxD requerido para la autorregulación negativa del gen luxR de Vibrio fischeri. (1992) Revista de Química Biológica. 267(11):7690-5.

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La expresión de la bioluminiscencia en la bacteria marina Vibrio fischeri está controlada por un mecanismo regulador único que depende de la densidad celular, denominado autoinducción. Los genes necesarios para la bioluminiscencia (los genes lux) están organizados en dos operones transcritos de forma divergente (luxR-luxICDABEG). Un operón (luxICDABEG) contiene los genes necesarios para la producción de luz (luxCDABE) y la síntesis de una molécula de señal difusible llamada autoinductor (luxI). El otro operón contiene el gen luxR, que codifica una proteína reguladora de la transcripción que activa la transcripción de ambos operones lux en presencia del autoinductor. Este mecanismo estimulador bidireccional conduce a un circuito de retroalimentación positiva que da lugar a un rápido aumento de la producción de luz a una densidad celular de cultivo particular, lo cual es característico de la autoinducción. La retroalimentación positiva transcripcional está aparentemente limitada por un circuito de autorregulación negativa a través del cual LuxR actúa para inhibir su propia síntesis. La autorregulación transcripcional negativa requiere un autoinductor, el operador lux ubicado en la región de control (que es el sitio de unión para LuxR) y secuencias de ADN de acción negativa en el operón luxICDABEG. El análisis de deleción del operón luxICDABEG demostró que un elemento de acción negativa se encuentra en el gen luxD en una posición a 2,0 kilobases del operador lux. La secuencia de nucleótidos de este elemento luxD es similar al operador lux (11 de 20 pares de bases idénticos) y puede funcionar como un sitio de unión de LuxR cuando reemplaza al operador lux en la región de control. Estos resultados sugieren que el elemento luxD funciona como un sitio de unión de baja afinidad para LuxR y que la ocupación de este sitio es necesaria para lograr la autorregulación transcripcional negativa de luxR.

1991

Shadel, G.S., Baldwin, T.O. La proteína LuxR de Vibrio fischeri es capaz de la estimulación bidireccional de la transcripción y regulación tanto positiva como negativa del gen luxR. (1991) J. Bacteriol. 173(2):568-74. DOI: 10.1128/jb.173.2.568-574.1991

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La regulación de los genes necesarios para la bioluminiscencia en la bacteria marina Vibrio fischeri (el regulón lux) es un proceso complejo que requiere la coordinación de varios sistemas. El nivel primario de regulación está mediado por una proteína reguladora positiva, LuxR, y una pequeña molécula difusible, la N-(3-oxo-hexanoil)-homoserina lactona, denominada autoinductor. La transcripción del gen luxR, que codifica la proteína reguladora, está regulada positivamente por el sistema AMP cíclico-CAP. El regulón lux de V. fischeri consta de dos operones transcritos de forma divergente, denominados operónL y operónR. La transcripción del operón hacia la derecha (operónR; luxICDABE), que consta de los genes necesarios para la síntesis del autoinductor (luxI) y la producción de luz (luxCDABE), es activada por LuxR de forma dependiente del autoinductor. El operón hacia la izquierda (operónL) está compuesto por un único gen conocido, luxR. También se ha demostrado que la proteína LuxR disminuye la transcripción del operónL a través de un mecanismo dependiente del autoinductor, regulando así negativamente su propia síntesis. En este artículo demostramos que la represión dependiente del autoinductor de la transcripción del operónL requiere no solo LuxR, sino también secuencias de ADN dentro del operónR que se encuentran aguas arriba del promotor del operónL. En ausencia de estas secuencias de ADN, la proteína LuxR provoca una activación dependiente del autoinductor de la transcripción del operónL. El operador lux, ubicado en la región de control entre los dos operones, era necesario tanto para las respuestas positivas como para las negativas dependientes del autoinductor. Mediante la titulación de altos niveles de LuxR suministrados en trans con autoinductor sintético, descubrimos que niveles bajos de autoinductor podían provocar una respuesta positiva incluso en presencia de las secuencias de ADN de acción negativa, mientras que niveles más altos de autoinductor daban lugar a una respuesta negativa. Sin estas secuencias de ADN en el operón R, LuxR y el autoinductor estimulaban la transcripción independientemente del nivel de autoinductor. Estos resultados sugieren que el cambio entre la estimulación y la represión de la transcripción del operón L está mediado por los niveles del complejo LuxR-autoinductor, lo que en estos experimentos refleja el nivel de autoinductor en el medio de crecimiento.

1990

Shadel, G.S., Young, R., Baldwin, T.O. Uso de lisis celular regulada en una selección genética letal en Escherichia coli: identificación de la región de unión al autoinductor de la proteína LuxR de Vibrio fischeri ATCC 7744. (1990) J. Bacteriol. 172(7):3980-7. DOI: 10.1128/jb.172.7.3980-3987.1990

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Shadel, G.S., Devine, J.H., Baldwin, T.O. Control del regulón de lux de Vibrio fischeri. (1990) J. Biolumin. Quimiolumin. 5(2):99-106. DOI: 10.1002/bio.1170050205

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La regulación de la expresión de la bioluminiscencia del regulón lux de Vibrio fischeri en Escherichia coli es consecuencia de una forma única de retroalimentación positiva superpuesta a un mecanismo de represión cis-activo poco definido. El regulón lux está formado por dos operones transcritos en sentido divergente. El operón izquierdo contiene un solo gen, luxR, que codifica una proteína activadora de la transcripción. El operón hacia la derecha contiene luxI, que junto con luxR y los 218 pares de bases que separan los dos operones constituye el circuito regulador primario, y los cinco genes estructurales, luxC, luxD, luxA, luxB y luxE, que son necesarios para la actividad bioluminiscente. La transcripción de luxR a partir de PL es estimulada por la unión del producto del gen crp de E. coli a la secuencia TGTGACAAAAATCCAA situada aguas arriba del promotor presunto. La unión de la proteína CAP pura de E. coli, en una reacción dependiente del AMPc, a la región reguladora de lux de V. fischeri ha sido demostrada mediante huella in vitro. El producto del gen luxI es una enzima que cataliza una reacción de condensación de sustratos citoplasmáticos para producir el autoinductor, N-(3-oxo-hexanoil) homoserina lactona. La acumulación del autoinductor, que es libremente difusible, da lugar a la formación de un complejo con LuxR. El complejo se une a la secuencia ACCTGTAGGATCGTACAGGT, situada aguas arriba de PR, para estimular la transcripción del operón hacia la derecha. El aumento de la transcripción de PR debería producir mayores niveles de LuxI y mayores niveles de autoinductor, lo que activaría aún más a LuxR. El sitio de unión de LuxR es también un sitio de unión de LexA, como lo demuestra el análisis de huellas in vitro. La transcripción basal tanto de PL como de PR es reprimida por secuencias dentro de la región codificante de luxR. (RESUMEN TRUNCADO A 250 PALABRAS)

1989

Devine, J.H., Shadel, G.S., Baldwin, T.O. Identificación del operador del regulón lux en la cepa ATCC7744 de Vibrio fischeri. (1989) Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 86(15):5688-92. DOI: 10.1073/pnas.86.15.5688

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Las cepas de Escherichia coli que portan un plásmido recombinante con el regulón lux de Vibrio fischeri expresan una luminiscencia que imita la de V. fischeri. El regulón lux está formado por dos operones transcritos en sentido divergente: el operón derecho (genes luxICDABE) y el operón izquierdo (gen luxR). Los genes luxR y luxI y la región de control que separa los dos operones proporcionan el control regulador primario sobre el regulón lux; los mecanismos reguladores dan lugar a un aumento drástico en la tasa de síntesis de luciferasa tras la inducción, aparentemente debido a un mecanismo único de retroalimentación positiva autorreguladora, y a una enorme diferencia (superior a 10⁴) en los niveles de luminiscencia en las células antes y después de la inducción. El modelo generalmente aceptado de regulación primaria de la bioluminiscencia en V. fischeri implica la interacción del producto del gen luxR y la N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona, el autoinductor producido por la enzima codificada por luxI, el primer gen del operón hacia la derecha, con una secuencia operadora dentro de la región de control para estimular la transcripción del operón hacia la derecha en un bucle de retroalimentación positiva. Hemos utilizado el mapeo por deleción de un vector reportero de transcripción para determinar la ubicación aproximada del operador. Mediante mutagénesis dirigida al sitio del operador presunto, hemos demostrado que la repetición invertida de 20 pares de bases ACCTGTAGGA/TCGTA CAGGT (donde la línea vertical es el centro de simetría), que presenta una sorprendente similitud con la secuencia de reconocimiento de la proteína represora pleiotrópica LexA, es el operador del regulón lux. También descubrimos que la deleción de secuencias aguas arriba del palíndromo conduce a un aumento de la transcripción desde el promotor hacia la derecha (PR), lo que indica un elemento de acción cis que reprime la transcripción en ausencia del complejo autoinductor LuxR. Las modificaciones del palíndromo que eliminan la estimulación por parte de LuxR-autoinductor de la transcripción desde el PR no tienen ningún efecto sobre la represión por los mecanismos de acción cis, lo que sugiere que el palíndromo no es necesario para la represión del operón hacia la derecha. Por lo tanto, parece que el gran aumento en la transcripción tras la inducción del regulón lux es el resultado de al menos dos mecanismos independientes, uno positivo y otro negativo.

Baldwin, T.O., Devine, J.H., Heckel, R.C., Lin, J.W., Shadel, G.S. La secuencia completa de nucleótidos de la regulona lux de Vibrio fischeri y la región luxABN de Photobacterium leiognathi y el mecanismo de control de la bioluminiscencia bacteriana. (1989) J. Biolumin. Quimiolumin. 4(1):326-41. DOI: 10.1002/bio.1170040145

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Hemos determinado la secuencia completa de nucleótidos de un fragmento de ADN de 7622 pares de bases procedente de la cepa ATCC7744 de Vibrio fischeri, que contiene toda la información necesaria para conferir bioluminiscencia regulada, transmitida por plásmido, a cepas de Escherichia coli. El regulón lux de V. fischeri consta de dos operones transcritos de forma divergente, L (izquierdo) y R (derecho), y al menos siete genes, luxR (operón L) y luxICDABE (operón R), así como la región de control intermedia. Los genes luxA y luxB codifican, respectivamente, las subunidades alfa y beta de la luciferasa. El orden de los genes luxCDABE observado en V. fischeri es el mismo que en V. harveyi. Hemos determinado la secuencia de luxAB y las regiones flanqueantes de Photobacterium leiognathi y hemos encontrado secuencias aguas arriba homólogas a luxC de las especies de Vibrio, pero entre luxB y luxE hay un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 227 aminoácidos (peso molecular de 26 229) que no se encuentra en esta ubicación en las especies de Vibrio. La secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína codificada es casi idéntica a la determinada por O'Kane y Lee (Universidad de Georgia) para la flavoproteína no fluorescente de una especie de Photobacterium estrechamente relacionada (Dr. Dennis O'Kane, comunicación personal). Por lo tanto, hemos designado a este gen como luxN. Existe una repetición invertida de 20 bases ACCTGTAGGAxTCGTACAGGT, centrada entre las bases 927 y 928 en la región entre los dos operones de V. fischeri. Esta región parece cumplir dos funciones: es fundamental para que la proteína LuxR ejerza su efecto y es un sitio de unión consenso para la proteína LexA de E. coli, una proteína reguladora negativa implicada en la respuesta SOS. Hay secuencias dentro de la región codificante de luxR que parecen funcionar de manera cis-activa para reprimir la transcripción tanto de los promotores hacia la izquierda como hacia la derecha en ausencia de las respectivas proteínas activadoras de la transcripción, lo que da como resultado bajos niveles basales de transcripción. Ahora parece claro que existen múltiples niveles de control en el sistema lux que permiten una modulación de la intensidad de la bioluminiscencia de más de cuatro órdenes de magnitud.

Gerald Shadel, doctor

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