3 de Julio de 2017

La técnica de microscopía inclinada revela mejor las estructuras proteicas

Investigador del Instituto Salk describe un nuevo método crio-EM para facilitar una mejor comprensión de las proteínas involucradas en la enfermedad

Noticias Salk


La técnica de microscopía inclinada revela mejor las estructuras proteicas

Investigador del Instituto Salk describe un nuevo método crio-EM para facilitar una mejor comprensión de las proteínas involucradas en la enfermedad

LA JOLLA—La forma convencional de colocar muestras de proteínas bajo un microscopio electrónico durante los experimentos crio-EM puede fracasar cuando se trata de obtener la mejor imagen de la estructura de una proteína. En algunos casos, inclinar una hoja de proteínas congeladas, entre 10 y 50 grados, mientras se encuentra bajo el microscopio, brinda datos de mayor calidad y podría conducir a una mejor comprensión de una variedad de enfermedades, según una nueva investigación dirigida por Salk. científico Dmitri Lyumkis.

Así como mirar las latas de sopa desde diferentes ángulos te permite ver diferentes formas, ver las proteínas inclinadas revela diferentes aspectos de su estructura.

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Crédito: Instituto Salk

"La gente ha tratado de implementar la inclinación antes, pero ha habido muchos desafíos", dice Lyumkis, miembro de Helmsley-Salk en el Instituto Salk y autor principal del nuevo trabajo, publicado el 3 de julio de 2017, en Nature Methods. “Hemos eliminado muchos de estos problemas con nuestro nuevo enfoque”.

Cryo-EM, o microscopía crioelectrónica, es una forma de microscopía electrónica de transmisión en la que las muestras se enfrían rápidamente por debajo del punto de congelación antes de que se tomen imágenes bajo el microscopio. A diferencia de otros métodos comúnmente utilizados para determinar la estructura de las proteínas, la crio-EM permite que las proteínas permanezcan en sus conformaciones naturales para la obtención de imágenes, lo que podría revelar nueva información sobre las estructuras. Comprender las estructuras de las proteínas es un paso vital para desarrollar nuevas terapias para enfermedades, como en el caso del VIH.

Los investigadores han asumido durante mucho tiempo que las proteínas adoptan conformaciones aleatorias en toda la rejilla congelada que está preparada para los experimentos de crio-EM, lo que significa que al tomar suficientes imágenes, los investigadores pueden armar una imagen 3D completa de la(s) forma(s) de la proteína desde todas las direcciones de imágenes. Pero para muchas proteínas, el enfoque parece fallar, y faltan partes de las estructuras de las proteínas.

“Los investigadores están empezando a pensar que las proteínas en una rejilla crio-EM no adoptan conformaciones aleatorias después de todo, sino que se adhieren a la parte superior o inferior de la rejilla de muestra en las orientaciones preferidas”, dice Lyumkis. “Por lo tanto, es posible que no obtengamos una imagen completa de las estructuras de las proteínas. Más importante aún, este comportamiento puede prohibir la determinación de la estructura por completo para muestras de proteínas seleccionadas”.

Para entender el problema, imagina que tratas de mirar las sombras de una docena de latas para averiguar su forma, pero solo ves círculos porque todas las latas están exactamente en posición vertical. Sin embargo, al hacer que la luz, o el haz de electrones, en el caso de crio-EM, golpee las muestras en ángulo, podrá ver mejor la forma real.

Cuando los investigadores intentaron inclinar muestras bajo un microscopio en el pasado, se vieron limitados por una resolución deficiente: un ángulo significa que el haz de electrones tiene que viajar a través de una rejilla más gruesa. También es más probable que las muestras se muevan dentro de la cuadrícula congelada cuando están inclinadas, desdibujando los datos. Y técnicamente, analizar los datos de una muestra inclinada también es más desafiante, ya que los métodos crio-EM se diseñaron con la suposición de que la rejilla que contenía proteínas siempre estaba a la misma distancia del microscopio.

Dmitri Lyumkis
Dmitri Lyumkis

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Crédito: Instituto Salk

Para hacer frente a estos desafíos, Lyumkis y sus colegas cambiaron los materiales utilizados para crear la cuadrícula crio-EM, grabaron películas de sus datos en lugar de imágenes fijas y desarrollaron nuevos métodos computacionales para analizar la información.

Cuando probaron el nuevo enfoque en la proteína hemaglutinina de la influenza, una proteína notoriamente difícil de caracterizar mediante crio-EM, el equipo descubrió que inclinar la muestra proporcionaba un conjunto de datos más completo. Cuando la muestra de proteína era plana, los algoritmos típicos introdujeron una forma de falso positivo en la proteína que no estaba respaldada por datos experimentales. Ese no era el caso cuando estaba inclinado.

“Debido a la geometría de la recopilación de datos cuando inclinamos, llenamos muchos más datos que caracterizan las moléculas, lo que nos brinda una imagen más completa de la forma de la proteína”, dice Lyumkis.

Los algoritmos que desarrollaron Lyumkis y su equipo, que incluyen formas de analizar si un experimento crio-EM está introduciendo datos incorrectos, así como los métodos para interpretar un experimento inclinado, ahora están disponibles abiertamente. Esperan que otros investigadores comiencen a usarlos y que se convierta en una métrica estándar para la validación de estructuras crio-EM (ya que la mayoría de las estructuras derivadas experimentalmente sufren de falta de información en diferentes grados).

“Una de las ideas que estamos analizando ahora es si la recopilación de datos siempre debe realizarse con una inclinación en lugar de la forma convencional”, dice Lyumkis. “No dolerá y debería ayudar”.

Otros investigadores del estudio fueron Yong Zi Tan, Philip Baldwin, Clinton Potter y Bridget Carragher del Centro de Biología Estructural de Nueva York, y Joseph David y James Williamson de El Instituto de Investigación Scripps.

El trabajo y los investigadores involucrados fueron apoyados por subvenciones de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur, la Leona M. y Harry B. Helmsley Charitable Trust, los Estados Unidos Los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Jane Coffin Childs, la Instituto Nacional de Envejecimiento, la Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y Fundación Simons.

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN

PERIODICO

Nature Methods

TÍTULO

Abordar la orientación preferida de las muestras en crio-EM de una sola partícula a través de la inclinación

AUTORES

Yong Zi Tan, Philip R Baldwin, Joseph H Davis, James R Williamson, Clinton S Potter, Bridget Carragher y Dmitry Lyumkis

Áreas de investigación

Para más información

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