Técnica de microscopía inclinada revela mejor las estructuras de proteínas

Técnica de microscopía inclinada revela mejor las estructuras de proteínas

Investigador del Instituto Salk describe un nuevo método de crio-EM para facilitar una mejor comprensión de las proteínas involucradas en enfermedades

LA JOLLA—La manera convencional de colocar muestras de proteínas bajo un microscopio electrónico durante experimentos de criomicroscopía electrónica (criomem) podría no ser la mejor opción para obtener la imagen más nítida de la estructura de una proteína. En algunos casos, inclinar una lámina de proteínas congeladas —entre 10 y 50 grados— mientras se encuentra bajo el microscopio, proporciona datos de mayor calidad y podría conducir a una mejor comprensión de una variedad de enfermedades, según una nueva investigación dirigida por un científico de Salk. Dmitry Lyumkis.

“La gente ha intentado implementar la inclinación antes, pero ha habido muchos desafíos”, dice Lyumkis, becario Helmsley-Salk en el Salk Institute y autor principal del nuevo trabajo, publicado el 3 de julio de 2017 en Naturaleza Métodos. Hemos eliminado muchos de estos problemas con nuestro nuevo enfoque.“

La crio-EM, o crio-microscopía electrónica, es una forma de microscopía electrónica de transmisión en la que las muestras se enfrían rápidamente a temperaturas bajo cero antes de ser fotografiadas bajo el microscopio. A diferencia de otros métodos comúnmente utilizados para determinar la estructura de las proteínas, la crio-EM permite que las proteínas permanezcan en sus conformaciones naturales para su obtención de imágenes, lo que podría revelar nueva información sobre las estructuras. La comprensión de las estructuras de las proteínas es un paso vital para el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades., como en el caso del VIH.

Los investigadores han asumido durante mucho tiempo que las proteínas adoptan conformaciones aleatorias en la rejilla congelada que se prepara para experimentos de criomicroscopía electrónica, lo que significa que al tomar suficientes imágenes, los investigadores pueden armar una imagen completa en 3D de la(s) forma(s) de la proteína desde todas las direcciones de imagen. Pero para muchas proteínas, el enfoque parece no ser suficiente y partes de las estructuras de las proteínas permanecen ausentes.

“Los investigadores están empezando a pensar que las proteínas en una rejilla de criomicroscopía electrónica no adoptan conformaciones aleatorias después de todo, sino que se adhieren a la parte superior o inferior de la rejilla de la muestra en orientaciones preferidas”, dice Lyumkis. “Por lo tanto, es posible que no estemos obteniendo una imagen completa de las estructuras de las proteínas. Más importante aún, este comportamiento puede impedir por completo la determinación de la estructura para muestras de proteínas seleccionadas’.”

Para entender el problema, imagina que tratas de observar las sombras de una docena de latas de conservas para determinar su forma, pero solo ves círculos porque todas las latas están exactamente verticales. Sin embargo, al hacer que la luz —o el haz de electrones, en el caso de la criomicroscopía electrónica— incida sobre las muestras en ángulo, podrías ver mejor su forma real.

Cuando los investigadores han intentado inclinar muestras bajo un microscopio en el pasado, se han visto limitados por una resolución deficiente: un ángulo implica que el haz de electrones debe atravesar una rejilla más gruesa. Las muestras también son más propensas a moverse dentro de la rejilla congelada cuando se inclinan, lo que difumina los datos. Y técnicamente, analizar datos de una muestra inclinada también es más desafiante, ya que los métodos de criomicroscopía electrónica se diseñaron con la suposición de que la rejilla que contenía las proteínas siempre estaba a la misma distancia del microscopio.

Para abordar estos desafíos, Lyumkis y sus colegas cambiaron los materiales utilizados para crear la rejilla de crio-EM, grabaron películas de sus datos en lugar de imágenes fijas y desarrollaron nuevos métodos computacionales para analizar la información.

Cuando probaron el nuevo enfoque en la proteína hemaglutinina de la influenza, una proteína notoriamente difícil de caracterizar mediante criomicroscopía electrónica, el equipo descubrió que inclinar la muestra proporcionó un conjunto de datos más completo. Cuando la muestra de proteína estaba plana, los algoritmos típicos introdujeron falsos positivos en la forma de la proteína que no estaban respaldados por datos experimentales. Ese no fue el caso cuando se inclinó.

“Debido a la geometría de la recolección de datos, cuando inclinamos, llenamos muchos más datos que caracterizan las moléculas, lo que nos da una imagen más completa de la forma de la proteína”, dice Lyumkis.

Los algoritmos que Lyumkis y su equipo desarrollaron —que incluyen formas de analizar si un experimento de crio-EM está introduciendo datos erróneos, así como métodos para interpretar un experimento inclinado— ahora están disponibles públicamente. Esperan que otros investigadores comiencen a usarlos y que se conviertan en una métrica estándar para la validación de estructuras de crio-EM (dado que la mayoría de las estructuras derivadas experimentalmente sufren de información faltante en diferentes grados).

“Una de las ideas que estamos considerando ahora es si la recopilación de datos siempre debería realizarse con una inclinación en lugar de la forma convencional”, dice Lyumkis. “No hará daño y debería ayudar”.”

Otros investigadores del estudio fueron Yong Zi Tan, Philip Baldwin, Clinton Potter y Bridget Carragher de la Centro de Biología Estructural de Nueva York, y Joseph David y James Williamson de El Instituto Scripps de Investigación.

El trabajo y los investigadores involucrados fueron apoyados por subvenciones de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación Singapur, la Fundación Benéfica Leona M. y Harry B. Helmsley, los EE. UU. Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Jane Coffin Childs, la Instituto Nacional de Envejecimiento, la Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y el Fundación Simons.