Salk-Wissenschaftler finden Weg, die Effektivität einer hochmodernen Mikroskopietechnik zu quantifizieren

Salk-Wissenschaftler finden Weg, die Effektivität einer hochmodernen Mikroskopietechnik zu quantifizieren

Der neue Ansatz hilft Forschern, die Auflösung von Kryo-EM zu bestimmen, was zu besseren Methoden zur Abbildung von Proteinen führt

LA JOLLA – 2017 berichteten Wissenschaftler des Salk Institute, dass Einfrieren einer Proteinprobe kippen Die Untersuchung mit einem Elektronenmikroskop war ein effektiver Ansatz, um bessere Informationen über seine Struktur zu erhalten und Forschern das Verständnis einer Vielzahl von Krankheiten zu ermöglichen, die von HIV bis Krebs reichen. Nun haben sie einen mathematischen Rahmen entwickelt, der einigen dieser ersten Beobachtungen zugrunde liegt.

Ihre neue Studie, veröffentlicht in Fortschritte in Biophysik und Molekularbiologie Am 13. September 2019 bietet eine Grundlage für die quantitative Bestimmung, wie sich Unterschiede im Blickwinkel auf die resultierenden 3D-Strukturen von Proteinen auswirken, und könnte anderen Forschern helfen, die beste Einrichtung für Experimente zur Verbesserung der Bildgebungstechnik namens Kryo-EM zu bestimmen.

“Dies liefert ein quantitatives Verständnis dafür, warum Schwankungen des Blickwinkels die Qualität der entstehenden 3D-Proteinstrukturen beeinflussen und wo wir uns verbessern könnten, um die Daten zu optimieren”, sagt Dmitri Lyumkis, einem Salk-Assistenzprofessor für Genetik und Koautor der neuen Arbeit. “Diese Art von theoretischen Rahmenbedingungen ist wichtig, um genau zu verstehen, wie Informationen aufgrund von Unvollkommenheiten, die mit dem bildgebenden Experiment verbunden sind, abgeschwächt werden, was uns letztendlich zu besseren Strukturen aus Kryo-EM-Daten führen wird.”

Bei der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) werden Proteine in ihrer natürlichen Form schnell eingefroren, bevor sie mit Elektronen beschossen werden. Durch die Detektion, wie die Elektronen beim Auftreffen auf die Probe gestreut werden, können Forscher die molekulare Struktur des Proteins oder Proteinkomplexes bestimmen. Im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren ist es für Wissenschaftler einfacher, Proteine für die Kryo-EM zu präparieren, und die Technik kann potenziell eine breitere Palette von Fragen in der Strukturbiologie beantworten. Ein seit langem bestehendes Problem bei der Kryo-EM ist jedoch, dass Proteine dazu neigen, an der Ober- oder Unterseite des Probenrasters, auf dem sie präpariert werden, anzuhaften. Diese selektiven Ausrichtungen bedeuten, dass Forscher die Struktur eines Proteins nicht immer aus jedem Winkel sehen können. Das Kippen der Probe, wie Lyumkis und seine Kollegen 2017 fanden, half, dieses Problem zu lösen.

“Wir wussten, dass das Kippen die Daten qualitativ in einigen Fällen verbesserte”, sagt Lyumkis. “Wir wussten nicht genau, in welchem ​​Ausmaß die Strukturen durch Variationen des Blickwinkels beeinflusst werden können.”

Kürzlich untersuchte Philip Baldwin, leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter am Salk und Koautor der Arbeit, eine Reihe von Kryo-EM-Daten, die unter verschiedenen Blickwinkeln gesammelt worden waren, als ihm auffiel, dass solche Variationen die Gesamtauflösung der resultierenden Proteinstruktur beeinflussten. Nach einigen Berechnungen stellte er fest, dass der Zusammenhang zwischen Blickwinkel und Auflösung auf alle Kryo-EM-Experimente übertragbar war.

Die neue Formel ermöglicht es Forschern, für jedes Protein bei jedem Neigungswinkel eine Zahl zu berechnen, die als Samplingkompensationsfaktor (SCF) bezeichnet wird. Je näher der SCF-Wert an 1 liegt, desto vollständiger ist die Proteinstruktur. Wenn der SCF statt 1 nur 0,5 beträgt, sind die Daten entweder unvollständig oder die Forscher müssen die Datenerfassung doppelt so lange durchführen, um die gleiche strukturelle Auflösung zu erzielen. Durch die Berechnung von SCF-Werten vor einem Experiment können Wissenschaftler ihren Neigungswinkel und die Datenerfassungszeit optimieren.

Die neuen quantitativen Formulierungen halfen Lyumkis und Baldwin auch dabei zu berechnen, wie unvollständig einige Kryo-EM-Datensätze sind. Zuvor mussten sie möglicherweise eine Datenmenge überfliegen und raten, ob sie eine gute oder schlechte Annäherung an die Struktur eines Proteins darstellte. Jetzt kann ihnen die SCF dies numerisch mitteilen.

“Das ist sehr praktisch”, sagt Baldwin. “Grundsätzlich sagt uns diese Formel, ob es sehr schlechte Bereiche des Proteins gibt, von denen wir keine Daten gesammelt haben.”

Lyumkis und Baldwin hoffen, dass die Verwendung der Formel zur Bewertung von Kryo-EM-Ergebnissen – die eine einfache Berechnung oder ein Code-Snippet beinhaltet – zum Standard wird und bei Experimenten und neuen Ansätzen zur Kryo-EM Anleitungen bietet. Dies würde zu schnelleren Entdeckungen in den grundlegenden Biowissenschaften und in der Medikamentenentwicklung führen.

Die Arbeit spiegelt einen wachsenden Trend sowohl am Salk Institute als auch an anderen Orten wider, computergestützte Ansätze in die biologische Forschung zu integrieren.

Lyumkis und Baldwin wurden durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt.

Über Fortschritte in der Biophysik und Molekularbiologie:

Fortschritte in der Biophysik und Molekularbiologie eine internationale Fachzeitschrift, deckt das Gebiet zwischen den physikalischen und biologischen Wissenschaften ab. Sie zeigt dem Physiker die große Vielfalt ungelöster Probleme auf, die in Biologie und Medizin auf Aufmerksamkeit warten.

Über das Salk Institute for Biological Studies:

Jede Heilung hat ihren Anfang. Das Salk Institute verkörpert Jonas Salks Mission, Träume kühn in die Realität umzusetzen. Seine international renommierten und preisgekrönten Wissenschaftler erforschen die fundamentalen Grundlagen des Lebens und suchen nach neuen Erkenntnissen in den Bereichen Neurowissenschaften, Genetik, Immunologie, Pflanzenbiologie und vielen mehr. Das Institut ist eine unabhängige gemeinnützige Organisation und ein architektonisches Wahrzeichen: bewusst klein, von Natur aus intim und furchtlos angesichts jeder Herausforderung. Ob Krebs oder Alzheimer, Altern oder Diabetes – am Salk Institute beginnen Heilungen. Erfahren Sie mehr unter: salk.edu.

DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2019.09.002