Novas tecnologias permitem detalhes melhores do que nunca sobre plantas geneticamente modificadas

Novas tecnologias permitem detalhes melhores do que nunca sobre plantas geneticamente modificadas

Os pesquisadores da Salk usaram as mais recentes tecnologias de sequenciamento de DNA para estudar exatamente o que acontece em nível molecular quando eles inserem novos genes nas plantas

LA JOLLA—Pesquisadores do Salk mapearam os genomas e epigenomas de linhagens de plantas geneticamente modificadas com a maior resolução já vista para revelar exatamente o que acontece em nível molecular quando um pedaço de DNA estranho é inserido. Suas descobertas, publicadas na revista PLoS Genetics em 18 de janeiro de 2019, elucidar os métodos de rotina usados ​​para modificar plantas e oferecer novas maneiras de minimizar com mais eficácia possíveis efeitos fora do alvo.

“Este foi realmente um ponto de partida para mostrar que é possível usar as mais recentes tecnologias de mapeamento e sequenciamento para observar o impacto da inserção de genes no genoma da planta”, diz o pesquisador do Howard Hughes Medical Institute José Ecker, professor do Laboratório de Biologia Molecular e Celular de Salk e chefe do Laboratório de Análise Genômica.

Quando um cientista quer colocar um novo gene em uma planta - para fins de pesquisa básica ou para melhorar a saúde ou nutrição de uma cultura alimentar - eles geralmente contam com Agrobacterium tumefaciens para fazer o trabalho. Agrobacterium é a bactéria que causa tumores galha da coroa, grandes protuberâncias nos troncos das árvores. Décadas atrás, os cientistas descobriram que, quando a bactéria infectava uma árvore, ela transferia parte de seu DNA para o genoma da árvore. Desde então, os pesquisadores têm cooptado essa capacidade de transferência de Agrobacterium para seus próprios propósitos, usando seu DNA de transferência (T-DNA) para mover um gene desejado para uma planta.

Recentemente, as tecnologias de sequenciamento de DNA começaram a sugerir que, quando o Agrobacterium O T-DNA é usado para inserir novos genes em uma planta, podendo causar alterações adicionais nas propriedades estruturais e químicas do DNA nativo.

“As empresas de biotecnologia gastam muito tempo e esforço para caracterizar plantas transgênicas e desconsiderar candidatos com alterações indesejadas sem entender – de uma perspectiva biológica básica – por que essas mudanças podem ter ocorrido”, diz Ecker. “Nossa nova abordagem oferece uma maneira de entender melhor esses efeitos e pode ajudar a acelerar o processo”.

“A maior incógnita era se e quantas cópias do T-DNA foram inseridas ao mesmo tempo que a peça que você queria”, diz Florian Jupe, ex-pesquisador associado da Salk que agora trabalha na Bayer Crop Science. Jupe, o pesquisador da equipe Salk, Mark Zander, e a assistente de pesquisa, Angeline Rivkin, são os primeiros autores do novo artigo, juntamente com Todd Michael do Instituto J. Craig Venter.

Como a abordagem do T-DNA pode levar à integração de muitas cópias de um gene desejado em uma planta, pode ser difícil estudar o resultado final com o sequenciamento de DNA padrão, pois a maioria das tecnologias luta para sequenciar trechos de DNA altamente repetitivos. Mas Ecker e seus colegas recorreram a uma nova combinação de abordagens – incluindo mapeamento óptico e sequenciamento de nanoporos – para observar esses longos trechos em alta resolução. Eles aplicaram as tecnologias a quatro linhas de T-DNA selecionadas aleatoriamente de Arabidopsis thaliana, uma planta modelo comumente usada em biologia. (Essas plantas são derivadas de uma grande população de mutantes insercionais de T-DNA que foram criados usando um Arabidopsis método de transformação, chamado mergulho floral, para estudar a função do gene.)

O mapeamento óptico revelou que as plantas tinham entre uma e sete inserções ou rearranjos distintos em seus genomas, variando em tamanho em quase dez vezes. O sequenciamento de nanoporos e a reconstrução dos genomas de duas linhagens confirmaram as inserções com resolução de uma única letra, incluindo segmentos inteiros de DNA que foram trocados – ou translocados – entre cromossomos em uma das linhas selecionadas. As próprias inserções de genes mostraram uma variedade de padrões, com o fragmento de DNA inserido às vezes embaralhado, invertido ou até mesmo silenciado.

“Este estudo não era possível até um ano atrás”, diz Michael. “O sequenciamento de nanoporos, que alguns chamam de 'santo graal' do sequenciamento de DNA, revolucionou a leitura até mesmo das regiões mais complexas do genoma que eram completamente inacessíveis e desconhecidas até agora.”

Finalmente, quando os pesquisadores estudaram pacotes de material genético chamados histonas, eles encontraram mudanças adicionais. As proteínas histonas empacotam o DNA em unidades estruturais e as modificações dessas histonas medeiam se um gene pode ser acessado para uso por uma célula (um nível de regulação chamado epigenética). Dependendo de onde o T-DNA foi integrado, certas modificações de histonas próximas apareceram ou desapareceram, potencialmente alterando a regulação ou ativação de outros genes próximos.

“Agora temos os primeiros insights de alta resolução sobre como as inserções de T-DNA podem moldar o ambiente local do epigenoma”, diz Zander.

Em um mundo ideal, dizem os pesquisadores, o T-DNA inseriria uma única cópia funcional de um gene desejado sem efeitos colaterais próximos no genoma de uma planta. Embora suas descobertas mostrem que esse raramente é o caso em Arabidopsis, seus métodos oferecem um caminho para uma melhor compreensão e vigilância dos efeitos.

“Esta tecnologia é empolgante porque nos dá uma visão muito mais clara do que está acontecendo em alguns desses transgênicos. Arabidopsis linhas”, diz Rivkin.

"Com Arabidopsis, é relativamente fácil porque tem um genoma tão pequeno, mas devido às melhorias contínuas na tecnologia de sequenciamento de DNA, esperamos que essa abordagem também seja possível para plantas cultivadas”, acrescenta Ecker, que ocupa o Salk International Council Chair in Genetics. “Os métodos atuais exigem a triagem de centenas de linhagens transgênicas para encontrar as de bom desempenho, como aquelas sem inserções extras, para que essa tecnologia possa fornecer uma abordagem mais eficiente”.

Outros pesquisadores do estudo foram Justin Sandoval, Huaming Chen, Rosa Castanon e Joseph Nery do Salk Institute; Timothy Motley do Instituto J. Craig Venter; e Keith Slotkin do Donald Danforth Plant Science Center.

O trabalho e os pesquisadores envolvidos foram apoiados por doações do Human Frontier Science Program, Salk Pioneer Postdoctoral Endowment Fund, Deutsche Forschungsgemeinschaft e Howard Hughes Medical Institute.

DOI: 10.1371/jornal.pgen.1007819