تقنية الفحص المجهري المائل تكشف بشكل أفضل عن تراكيب البروتين

تقنية الفحص المجهري المائل تكشف بشكل أفضل عن تراكيب البروتين

يصف باحث معهد Salk طريقة cryo-EM الجديدة لتسهيل فهم البروتينات المتضمنة في المرض بشكل أفضل

LA JOLLA - الطريقة التقليدية لوضع عينات البروتين تحت المجهر الإلكتروني أثناء تجارب cryo-EM قد تسقط عندما يتعلق الأمر بالحصول على أفضل صورة لبنية البروتين. في بعض الحالات ، يؤدي إمالة ورقة من البروتينات المجمدة - في أي مكان من 10 إلى 50 درجة - نظرًا لوقوعها تحت المجهر ، إلى توفير بيانات عالية الجودة ويمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لمجموعة متنوعة من الأمراض ، وفقًا لبحث جديد بقيادة Salk عالم ديمتري ليومكيس.

يقول ليومكيس ، زميل هيلمسلي-سالك في معهد سالك وكبير مؤلفي العمل الجديد ، الذي نُشر في 3 يوليو 2017 ، في طرق الطبيعة. "لقد قضينا على العديد من هذه المشاكل من خلال نهجنا الجديد."

Cryo-EM ، أو المجهر الإلكتروني بالتبريد ، هو شكل من أشكال المجهر الإلكتروني للإرسال حيث يتم تبريد العينات بسرعة إلى ما دون درجة التجمد قبل تصويرها تحت المجهر. على عكس الطرق الأخرى المستخدمة بشكل شائع لتحديد بنية البروتينات ، يسمح cryo-EM للبروتينات بالبقاء في توافقها الطبيعي للتصوير ، مما قد يكشف عن معلومات جديدة حول الهياكل. يعد فهم بنية البروتينات خطوة حيوية لتطوير علاجات جديدة للأمراض ، كما في حالة فيروس نقص المناعة البشرية.

افترض الباحثون منذ فترة طويلة أن البروتينات تتبنى توافقًا عشوائيًا في جميع أنحاء الشبكة المجمدة التي تم إعدادها لتجارب cryo-EM ، مما يعني أنه من خلال التقاط صور كافية ، يمكن للباحثين تجميع صورة كاملة ثلاثية الأبعاد لشكل (أشكال) البروتين من جميع اتجاهات التصوير. لكن بالنسبة للعديد من البروتينات ، يبدو أن هذا النهج غير كافٍ ، ولا تزال أجزاء من هياكل البروتينات مفقودة.

يقول ليومكيس: "بدأ الباحثون في الاعتقاد بأن البروتينات الموجودة على شبكة EM cryo لا تتبنى مطابقة عشوائية بعد كل شيء ، بل تلتصق بأعلى أو أسفل شبكة العينة في الاتجاهات المفضلة". وبالتالي قد لا نحصل على الصورة الكاملة لبنى البروتينات. والأهم من ذلك ، أن هذا السلوك يمكن أن يمنع تحديد البنية تمامًا لعينات بروتينية مختارة. "

لفهم المشكلة ، تخيل محاولة النظر إلى ظلال عشرات علب الصفيح لمعرفة شكلها ولكن رؤية الدوائر فقط لأن كل العلب منتصبة تمامًا. من خلال جعل الضوء - أو شعاع الإلكترون ، في حالة cryo-EM - اصطدم بالعينات بزاوية ، على الرغم من ذلك ، ستتمكن من رؤية الشكل الحقيقي بشكل أفضل.

عندما حاول الباحثون إمالة العينات تحت المجهر في الماضي ، كانت محدودة بسبب ضعف الدقة: الزاوية تعني أن شعاع الإلكترون يجب أن ينتقل عبر شبكة أكثر سمكًا. من المرجح أيضًا أن تتحرك العينات داخل الشبكة المجمدة عند إمالتها ، مما يؤدي إلى تعتيم البيانات. ومن الناحية الفنية ، يعد تحليل البيانات من عينة مائلة أيضًا أكثر صعوبة ، حيث تم تصميم طرق cryo-EM على افتراض أن الشبكة التي تحتوي على البروتينات كانت دائمًا على نفس المسافة من المجهر.

لمواجهة هذه التحديات ، قام Lyumkis وزملاؤه بتغيير المواد المستخدمة لإنشاء شبكة cryo-EM ، وسجلوا أفلامًا لبياناتهم بدلاً من الصور الثابتة ، وطوّروا طرقًا حسابية جديدة لتحليل المعلومات.

عندما اختبروا النهج الجديد على بروتين هيماجلوتينين الإنفلونزا ، وهو بروتين معروف بصعوبة توصيفه باستخدام cryo-EM ، وجد الفريق أن إمالة العينة تعطي مجموعة بيانات أكثر اكتمالاً. عندما كانت عينة البروتين مسطحة ، قدمت الخوارزميات النموذجية شكلًا إيجابيًا خاطئًا للبروتين الذي لم يتم دعمه بالبيانات التجريبية. لم يكن هذا هو الحال عندما كانت مائلة.

يقول ليومكيس: "نظرًا لهندسة جمع البيانات عندما نميل ، فإننا نملأ الكثير من البيانات التي تميز الجزيئات ، مما يمنحنا صورة أكثر اكتمالاً عن شكل البروتين".

الخوارزميات التي طورها ليومكيس وفريقه - والتي تتضمن طرقًا لتحليل ما إذا كانت تجربة EM cryo تقدم بيانات سيئة ، وكذلك طرق تفسير التجربة المائلة - متاحة الآن بشكل مفتوح. إنهم يأملون أن يبدأ الباحثون الآخرون في استخدامها وأن يصبح مقياسًا قياسيًا للتحقق من صحة بنية cryo-EM (نظرًا لأن معظم الهياكل المشتقة تجريبياً تعاني من فقدان المعلومات بدرجات مختلفة).

يقول ليومكيس: "إحدى الأفكار التي نبحثها الآن هي ما إذا كان ينبغي دائمًا إجراء جمع البيانات بشكل مائل بدلاً من الطريقة التقليدية". "لن تؤذي ويجب أن تساعد."

الباحثون الآخرون في الدراسة هم يونغ زي تان وفيليب بالدوين وكلينتون بوتر وبريدجيت كاراجر من مركز نيويورك للبيولوجيا الإنشائيةوجوزيف ديفيد وجيمس ويليامسون معهد سكريبس للبحوث.

تم دعم العمل والباحثين المشاركين من خلال منح من وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث في سنغافورةأطلقت حملة ليونا م. وهاري بي هيلمسلي، الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحةأطلقت حملة مؤسسة جين كوفين تشايلدزأطلقت حملة المعهد الوطني للشيخوخةأطلقت حملة المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة و مبادئ السلوك مؤسسة سايمونز.