Публикации - Институт биологических исследований Солка

все публикации

Мартин, Г.Д., Калагири, Р., Веджиани, Г., Стэнфилд, Р.Л., Чоудхури, И., Сала, М., Мейзенхельдер, Дж., Чен, К., Бисвас, А., Леви, Р.М., Люмкис, Д., Уилсон, И.А., Хантер, Т., Сидху, С.С. Использование фагового дисплея для рационального конструирования гуманизированного антитела, специфичного к 3'-фосфогистидину, с более высокой аффинностью. (2025) Коммун Хим. 8(1):381. DOI: 10.1038/s42004-025-01768-9

+ развернуть аннотацию

Фосфорилирование гистидина — это неканоническая посттрансляционная модификация (ПТМ), имеющая изоформы 1-фосфогистидина (1-pHis) и 3-фосфогистидина (3-pHis), которая недостаточно изучена из-за отсутствия надежных реагентов, включая высокоаффинные антитела, специфичные к pHis. Создание антител к pHis представляет собой сложную задачу из-за нестабильной природы его фосфорамидатной (PN) связи. Мы разработали стратегию для in vitro конструирования антител для обнаружения нативных мишеней 3-pHis, в которой кроличье моноклональное антитело SC44-8 против 3-pTza гуманизировано в каркас (hSC44), подходящий для фагового дисплея. Шесть уникальных библиотек каркасов hSC44 с Fab-фрагментами, представленных на фагах, были протестированы на наличие антител, которые связывались с 3-pHis с более высокой аффинностью и обладали специфичностью к 3-pHis по сравнению с 3-pTza. hSC44.20N32F, наиболее эффективно модифицированное антитело, обладает примерно в 10 раз большей аффинностью к 3-pHis, чем исходный hSC44. Одиннадцать новых структур Fab-фрагментов, включая первые структуры антитело-pHis-пептида, вместе со структурными и квантово-механическими расчетами, позволили получить молекулярное представление о различении 3-pHis и 3-pTza с помощью hSC44.20N32F и повышении аффинности, достигнутом благодаря модификации. Мы продемонстрировали полезность этих высокоаффинных 3-pHis-специфических антител для распознавания pHis-белков в клетках млекопитающих с помощью иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентного окрашивания. Наша работа описывает общий метод модификации лабильных PTM-специфических антител и предоставляет новые антитела для исследования роли 3-pHis в клеточной биологии.

Цзин, Т., Шан, З., Динь, Т., Бисвас, А., Янг, С., Гринвуд, Дж., Ли, М., Чжан, З., Грей, Г., Шин, Х.Дж., Чжоу, Б., Пассос, Д., Штруценберг, Т.С., Айер, С., Андраде, Л., Чжан, Ю., Ли, З., Крейги, Р., Энгельман, А.Н., Кварацхелия М., Люмкис, Д. Олигомерные структуры интегразы ВИЧ-1 демонстрируют функциональную пластичность в сборке интасомы и связывании РНК. (2025) Природа связи. 16(1):9430. DOI: 10.1038/s41467-025-64479-8

+ развернуть аннотацию

Интеграза (ИН) выполняет две важные функции во время репликации ВИЧ-1. Во время проникновения ИН функционирует в составе олигомерной «интасомы», катализируя интеграцию вирусной ДНК в хроматин хозяина. На поздних стадиях инфекции тетрамерная ИН связывается с вирусной РНК и организует конденсацию рибонуклеопротеиновых комплексов в капсидное ядро. Молекулярная архитектура комплексов ИН ВИЧ-1, опосредующих эти различные события, остается неизвестной. Кроме того, тетрамер ИН является важной противовирусной мишенью для исследуемых аллостерических ингибиторов ИН. В данном исследовании мы определили криоэлектронно-микроскопические структуры тетрамеров ИН ВИЧ-1 дикого типа и гексадекамеров интасомы. Наши структуры демонстрируют замечательную пластичность, которая использует С-концевые домены ИН и прилегающие линкеры для сборки функционально различных олигомерных форм. Изменение недавно обнаруженного консервативного интерфейса показало, что обе функции ИН коррелируют с тетрамеризацией in vitro и во время инфекции ВИЧ-1. В совокупности наши результаты показывают, как пластичность интегразы координирует ее разнообразные молекулярные функции, и предлагают рабочую модель связывания интегразы с вирусной РНК. Более того, наша структура тетрамера интегразы предоставляет атомные чертежи для рациональной разработки улучшенных аллостерических ингибиторов.

Чжао, XZ, Ли, М., Смит, С.Дж., Карбаси, А., Чоудхури, И., Цзин, Т., Люмкис, Д.Крейги, Р., Берк, Т.Р. Взаимодействие типа «пи-пи» с вирусной ДНК способствует повышению эффективности ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе нафтиридина. (2025) NAR Mol Med. 2(4):ugaf039. DOI: 10.1093/narmme/ugaf039

+ развернуть аннотацию

Лекарственная устойчивость остается серьезным препятствием на пути к выявлению эффективных методов лечения ВИЧ-1-инфекции. Ингибиторы интегразы (INSTI) являются препаратами первой линии, используемыми в комбинированной антиретровирусной терапии, но их эффективность может быть снижена из-за появления мутаций, связанных с резистентностью. Разработка соединений, которые сохранят свою эффективность против лекарственно-устойчивых вариантов, представляет значительный интерес. В данной работе мы сообщаем о синтезе INSTI на основе нафтиридина с комбинацией 4-амино- и 5-гидроксиметильных групп. Сравнение профилей резистентных мутаций новых соединений с одобренными FDA INSTI второго поколения показало, что ведущие соединения сопоставимы или превосходят эффективность клинически используемых препаратов против некоторых из наиболее распространенных мутаций лекарственной устойчивости, возникающих в вирусных изолятах, полученных от пациентов. Структуры интасом ВИЧ-1 с двумя лучшими ингибиторами интегразы на основе нафтиридина, полученные с помощью криогенной электронной микроскопии высокого разрешения (крио-ЭМ), показывают, как эти ингибиторы усиливают взаимодействие с вирусной ДНК, в частности, за счет оптимизированного стекирования ДНК. Молекулярно-динамическое моделирование в сочетании с квантово-механическими и молекулярно-механическими расчетами указывает на то, что взаимодействие между внутримолекулярными связями, геометрией стекирования, резонансными эффектами и распределением заряда определяет связывание лекарственного препарата в активном центре интасомы. Полученные данные механистически объясняют, как ключевые взаимодействия способствуют повышению противовирусной эффективности против устойчивых к лекарствам мутантов, и указывают на новую стратегию борьбы с резистентностью ВИЧ-1.

Ли, З., Бургос-Браво, Ф., Сюй, К., Ли, Ц., Кван, К.Ю., Тонг, А.Б., Шань, З., Ван, Х., Такаку, М., Ли, Дж., Ши, З., Люмкис, Д., Бустаманте, К., Фей, Дж. Фазоразделенные конденсаты NDF-FACT облегчают удлинение транскрипции на хроматине. (2025) Природа клеточной биологии. DOI: 10.1038/s41556-025-01778-8

+ развернуть аннотацию

Механизм, посредством которого комплекс FACT (Fact) способствует транскрипции хроматина, позволяет РНК-полимеразе II преодолевать хроматиновые барьеры в клетках, остаётся недостаточно изученным, особенно учитывая ограниченное прямое взаимодействие FACT с полимеразами, ДНК или нуклеосомами. В данной работе мы демонстрируем, что фазовое разделение, опосредованное фактором дестабилизации нуклеосом (NDF), является ключевым механизмом, обеспечивающим функционирование FACT во время элонгации транскрипции. С помощью биохимических и одномолекулярных анализов мы обнаружили, что конденсаты NDF-FACT создают специализированную биохимическую среду, которая повышает эффективность транскрипции примерно в 20 раз по сравнению с одним FACT. Эти динамические конденсаты образуются при транскрибировании РНК-полимеразой II и перемещаются по хроматину, где они способствуют эффективной разборке нуклеосом на барьерах, сохраняя при этом гистоны на ДНК для сохранения целостности хроматина. В стволовых клетках человека разрушение этих конденсатов приводит к транскрипционным дефектам по всему геному и нестабильности хроматина, что отражает эффекты истощения FACT. Показав, что разделение фаз усиливает функцию FACT во время элонгации транскрипции, наше исследование раскрывает ключевой механизм, который сохраняет целостность хроматина и транскрипционный гомеостаз в стволовых клетках человека.

Родригес, З.К., Андино-Монкада, Дж.Р., Бут, С.А., Мехрани, А., Ранавира, А., Ши, Дж., Андраде, Л.Р., Сингх, С.П., Струценберг, Т.С., Марин, М., Герреро-Феррейра, Р., Рахмани, Х., Гротьян, Д.А., Стагг, С., Меликян, ГБ, Люмкис, Д., Фрэнсис, AC Флуоресцентная визуализация с временным разрешением и корреляционная криоэлектронная томография для изучения структурных изменений капсида ВИЧ-1. (2025) ACS Nano. DOI: 10.1021 / acsnano.5c06724

+ развернуть аннотацию

Конический капсид ВИЧ-1 защищает внутренний вирусный геном и облегчает инфицирование клеток-мишеней. Высокоэффективные противовирусные препараты, такие как клинически одобренный препарат ленакапавир (LEN), блокируют репликацию ВИЧ-1, изменяя структуру капсида и модулируя его функцию. Однако структурные исследования капсида ВИЧ-1, его разборки или стабилизации противовирусными препаратами были сложной задачей. В данной работе мы разработали рабочий процесс корреляционной световой и криоэлектронной микроскопии (CLEM) для характеристики морфологии капсида ВИЧ-1, начиная с небольшого объема вирусных частиц, собранных из клеточных супернатантов. Мы сообщаем о двух важных улучшениях в подготовке образцов, а именно: (1) аффинный захват и удержание флуоресцентных частиц ВИЧ-1 на сетках крио-ЭМ для картирования расположения вируса/капсида до витрификации образца и (2) оптимизированные протоколы выравнивания для последующей идентификации и корреляции интересующих областей на флуоресцентных и крио-ЭМ изображениях. Эти усовершенствования позволяют использовать воспроизводимый рабочий процесс CLEM для точного определения местоположения капсидов при криоэлектронной томографии (крио-ЭТ). Используя этот подход, мы получили ультраструктуры капсидов ВИЧ-1, обработанных LEN и клеточным метаболитом инозитолгексафосфатом (IP6), выявив различные способы стабилизации капсидной решетки. Наконец, используя наш рабочий процесс CLEM, мы продемонстрировали возможность корреляции флуоресцентной визуализации разборки капсида с временным разрешением со структурами конечных точек крио-ЭТ. Эти достижения облегчат структурные исследования in vitro для определения механизмов стабилизации и разборки капсида ВИЧ-1. Разработанный здесь рабочий процесс CLEM может быть также распространен на изучение структурных изменений других вирусов в ответ на различные стимулы.

Шэн К., Донг Х., Айер С., Ли Дж., Дорджевич-Марквардт С., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Зондирование антисмысловыми олигонуклеотидами как структурная платформа для изучения сборки рибонуклеопротеинового комплекса. (2025) Природа связи. 16(1):6642. DOI: 10.1038/s41467-025-61640-1

+ развернуть аннотацию

Исследование сложной и быстрой кинетики сворачивания крупных РНК-белковых комплексов (РНП), таких как бактериальная рибосома, остаётся сложной задачей в структурной биологии. Предыдущие генетические подходы к сборке зондов были сосредоточены на модуляции экспрессии либо r-белков, либо факторов сборки. В данном случае антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) использовались для нарушения нативных взаимодействий РНК/РНК и РНК/белок с целью получения ранее не охарактеризованных промежуточных продуктов сворачивания. В анализе котранскрипционной сборки рибосом in vitro были идентифицированы 10 ингибиторов сборки ASO. С помощью криоэлектронной микроскопии было выявлено 38 промежуточных структур, возникающих в результате специфического ингибирования, вызванного 6 ингибиторными ASO. Наличие заметного промежуточного класса предоставило убедительные доказательства независимого сворачивания доменов рРНК перед правильной междоменной стыковкой. Три ПНК, нацеленные на домен I 23S рРНК, дополнительно подразделяют ранее идентифицированное ядро сборки на более мелкие блоки, представляющие самые ранние этапы сборки. Полученный граф сборки демонстрирует РНК-докинг, управляемый шаблоном, в определённых областях в виде фолдонов и консолидацию доменов, что даёт иерархическое представление процесса сборки РНП. Этот подход не только выявляет потенциальные цели для разработки антибиотиков, но и создаёт платформу для исследования структуры и динамики сборок РНП.

Сан К., Айер С., Бисвас А., Холдейн А., Чаттерджи С., Матубаяси Н., Люмкис, Д., Леви, Р.М. Гидратация de Novo крио-ЭМ-реконструкций посредством моделирования молекулярной динамики избыточного химического потенциала. (2025) биоRxiv. DOI: 10.1101 / 2025.05.23.655847

+ развернуть аннотацию

Предсказание точного положения молекул воды на границе раздела белков остается сложной задачей, стимулируя активные исследования в этой области. Здесь мы представляем новый подход, основанный на моделировании молекулярной динамики, который использует статистические термодинамические сигнатуры воды на границах раздела белков для повышения точности размещения воды на крио-ЭМ картах, используя апоферритин в качестве модельной эталонной системы. Энергии взаимодействия растворителя с белком недостаточно, чтобы различать высоко- и низкоконсенсусные положения воды, что согласуется с отчетами о более ранних работах. Вместо этого мы используем подробный статистико-термодинамический анализ, основанный на избыточном химическом потенциале (WT) — мере термодинамического баланса между энергией взаимодействия молекулы воды на границе раздела с белком и ее свободной энергией взаимодействия со всеми другими молекулами растворителя. WT пропорционален логарифму отношения локальной плотности молекул воды на границе раздела белков к объемной плотности. 85% из 100 лучших мест расположения водных объектов с наиболее благоприятными значениями избыточного химического потенциала представлены на одной или нескольких картах крио-ЭМ высокого разрешения, хранящихся в PDB, а 70% из 200 лучших мест расположения водных объектов, индексированных по избыточному химическому потенциалу, представлены на картах крио-ЭМ. Эта работа открывает путь к разработке инструмента уточнения данных крио-ЭМ, который интегрирует моделирование молекулярной динамики с данными крио-ЭМ для высокоточного моделирования водных сетей.

Бисвас А., Чоудхури И., Хуанг К., Сунь К., Сали А., Эчеверрия И., Холдейн А., Леви Р.М., Люмкис, Д. Эволюционная последовательность и структурная основа эпистатического происхождения лекарственной устойчивости у ВИЧ. (2025) биоRxiv. DOI: 10.1101 / 2025.04.30.651576

+ развернуть аннотацию

Возникновение лекарственной устойчивости у вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) остаётся серьёзной проблемой для долгосрочной эффективности антиретровирусной терапии (АРТ). Всё больше данных подчёркивают важнейшую роль эпистаза – зависимости эффектов мутаций от контекста последовательности – в формировании ландшафта приспособленности ВИЧ под давлением отбора, индуцированного АРТ. Однако биофизические истоки эпистатических взаимодействий, участвующих в возникновении мутаций лекарственной устойчивости (DRM), остаются неясными. Являются ли мутационные корреляции «внутренними» свойствами белка или они возникают вследствие связывания с препаратом? Мы используем статистическую энергетическую модель Поттса, основанную на последовательностях белка ВИЧ-1, полученных от пациентов, для построения вычислительных циклов двойных мутантов, которые исследуют попарный эпистаз для всех наблюдаемых мутаций в трёх основных ферментах-мишенях препаратов ВИЧ. Мы обнаружили, что наиболее сильные эпистатические эффекты возникают между мутациями в позициях остатков, которые часто мутируют в ходе АРТ, называемых позициями, ассоциированными с резистентностью. Чтобы исследовать структурные истоки наиболее сильных эпистатических взаимодействий, мы провели около 100 экспериментов по молекулярной динамике с возмущениями свободной энергии, показав, что основной вклад в парный эпистаз между DRM обусловлен кооперативным влиянием на стабильность и фолдинг белков как внутренним следствием мутационного ландшафта белков. В совокупности эти результаты подтверждают механизм эволюции резистентности, посредством которого вирусы избегают давления лекарственных препаратов, избирательно порождая мутации в «внутренне» связанных участках, что позволяет им кооперативно компенсировать ущерб, наносимый индивидуальными DRM.

Струценберг, Т.С., Манн, МД, Ли, К., Шин, Х., Келси, Дж., Айер, С., Ю, Дж., Грей, Г., Чжан, З., Шань, З., Чжоу, Б., Чжэн, Ю., Гриффин, П.Р., Люмкис, Д. Взаимодействие нуклеосом регулирует структуру и динамику RORγt. (2025) биоRxiv. DOI: 10.1101 / 2025.03.10.642251

+ развернуть аннотацию

Орфанный рецептор гамма, связанный с ретиноевой кислотой (RORγt), действует как основной активатор транскрипции в развитии клеток Th17 и функционирует, опосредуя адаптивную иммунную защиту от патогенной инфекции. RORγt вовлекает доступные элементы ответа ДНК в геноме и взаимодействует с коактиваторными белками и вспомогательными факторами транскрипции, чтобы управлять экспрессией генов. Однако то, как хроматиновая среда опосредует структуру, динамику и функцию RORγt, остается неясным. В данной работе мы профилируем, как нуклеосома способствует или ограничивает доступ к основным элементам ответа ДНК RORγt, обнаруженным в нативных энхансерах и промоторах, выявляя преимущественное связывание в областях свободной ДНК и сайтах входа/выхода нуклеосомы с разрешением до одной пары оснований. Измерения фазы раствора с использованием обмена водорода и дейтерия в сочетании с масс-спектрометрией выявляют новые аллостерические эффекты, которые влияют на связывание RORγt и опосредуют динамику хроматина. Высокоразрешенная структура RORγt, связанного с нуклеосомой, показывает, как структурированные элементы собираются, обеспечивая специфичность связывания и авидность с субстратами хроматина. Полученные наблюдения указывают на модель активации, в которой связывание RORγt с хроматинизированной ДНК способствует привлечению корегулятора и декомпактизации хроматина.

Хортон, Северная Каролина, Люмкис, Д. Структуры, механизмы и кинетические преимущества механизма формирования нитей SgrAI. (2024) Критические обзоры по биохимии и молекулярной биологии.: 1-39 DOI: 10.1080/10409238.2024.2440315

+ развернуть аннотацию

В этом обзоре документируются исследования, приведшие к беспрецедентному открытию филаментации как способа регуляции фермента в эндонуклеазе рестрикции типа II SgrAI. Филаментация определяется здесь как линейная или спиральная полимеризация одного фермента, как это происходит для SgrAI, и теперь, как было показано, происходит во многих других ферментных системах, включая консервативные метаболические ферменты. В случае SgrAI филаментация активирует скорость расщепления ДНК до 1000 раз, а также изменяет специфичность последовательности ДНК фермента. Исследования начались с наблюдения, что SgrAI расщепляет два типа последовательностей распознавания, первичные и вторичные, но расщепляет вторичные последовательности только в том случае, если они присутствуют на той же ДНК, что и по крайней мере одна первичная. Измерения скорости расщепления ДНК показали, что первичная последовательность является как субстратом, так и аллостерическим эффектором SgrAI. Биофизические измерения показали, что активированная форма SgrAI, стимулированная связыванием с первичной последовательностью, состояла из различного количества SgrAI, связанных с ДНК. Структурные исследования выявили активированное состояние SgrAI как левозакрученную спиральную нить, которая стабилизирует измененную конформацию фермента, которая связывает второй двухвалентный катион в активном центре. Продолжаются попытки определить механизм изменения специфичности последовательности ДНК, и обсуждаются текущие модели. Наконец, глобальное кинетическое моделирование реакции расщепления ДНК, опосредованной нитью, и симуляции активности предполагают, что механизм нити эволюционировал для быстрого расщепления вторгающейся ДНК, защищая при этом геном хозяина.

Мартин, Г.Д., Калагири, Р., Веджиани, Г., Стэнфилд, Р.Л., Чоудхури, И., Сала, М., Мейзенхельдер, Дж., Чен, К., Бисвас, А., Леви, Р.М., Люмкис, Д., Уилсон, И.А., Хантер, Т., Сидху, С.С. Использование фагового дисплея для рациональной разработки более высокоаффинного гуманизированного 3'-фосфогистидин-специфического антитела. (2024) биоRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.11.04.621849

+ развернуть аннотацию

Фосфорилирование гистидина (pHis) является неканонической посттрансляционной модификацией (PTM), которая исторически недостаточно изучена из-за отсутствия надежных реагентов, необходимых для ее исследования, таких как высокоаффинные pHis-специфические антитела. Разработка pHis-специфических антител очень сложна из-за лабильной природы фосфорамидатной (PN) связи и строгих требований к селективному распознаванию двух изоформ, 1-фосфогистидина (1-pHis) и 3-фосфогистидина (3-pHis). Здесь мы представляем стратегию разработки антител для обнаружения нативных 3-pHis-мишеней. В частности, мы гуманизировали кроличье SC44-8 анти-3-pTza (стабильный 3-pHis-миметик) mAb в каркас (далее именуемый hSC44), который был пригоден для фагового дисплея. Затем мы сконструировали шесть уникальных библиотек Fab-фагов, отображаемых с помощью каркаса hSC44, и выбрали связыватели 3-pHis с высокой аффинностью. Наша стратегия отбора была тщательно разработана для обогащения антител, которые связывают 3-pHis с высокой аффинностью и имеют специфичность к 3-pHis по сравнению с 3-pTza. hSC44.20N32F, лучшее сконструированное антитело, имеет примерно в 10 раз более высокую аффинность к 3-pHis, чем родительское hSC44. Одиннадцать новых структур Fab, включая первые сообщенные структуры пептидов антитело-pHis, были решены с помощью рентгеновской кристаллографии. Структурные и квантово-механические расчеты предоставили молекулярные сведения о различении 3-pHis и 3-pTza различными вариантами hSC44 и об увеличении их аффинности, полученном с помощью инженерии. Кроме того, мы демонстрируем полезность этих недавно разработанных высокоаффинных 3-pHis-специфических антител для распознавания белков pHis в клетках млекопитающих с помощью иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентного окрашивания. В целом, наша работа описывает общий метод конструирования PTM-специфических антител и предоставляет набор новых антител для дальнейших исследований роли 3-pHis в клеточной биологии.

Шан З., Риверо-Гамес А., Люмкис, Д., Хортон, Северная Каролина Двухметаллический ионный механизм расщепления ДНК активированным нитевидным SgrAI. (2024) Журнал биологической химии.:107576 DOI: 10.1016/j.jbc.2024.107576

+ развернуть аннотацию

В последние годы все большее внимание привлекают ферменты, образующие нитевидные ансамбли с модулированной ферментативной активностью. SgrAI представляет собой эндонуклеазу рестрикции типа II, специфичную для последовательности, которая образует полимерные нити с ускоренной активностью расщепления ДНК и расширенной специфичностью последовательностей ДНК. Предыдущие исследования предложили механистическую модель, связывающую структурные изменения, сопровождающие филаментацию SgrAI, с его ускоренной активностью расщепления ДНК. В этой модели конформационные изменения, специфичные для нитевидного SgrAI, максимизируют контакты между различными копиями фермента внутри нити и создают второй сайт связывания двухвалентных катионов в каждой субъединице, что, в свою очередь, облегчает реакцию расщепления ДНК. Однако наше понимание атомного механизма катализа является неполным. Здесь мы представляем две новые структуры нитевидного SgrAI, решенные с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Первая структура, разрешенная до 3.3 Å, представляет собой нитевидный SgrAI, содержащий мутацию активного сайта, предназначенную для остановки реакции расщепления ДНК, которая раскрывает ферментативную конфигурацию до расщепления ДНК. Вторая структура, разрешенная до 3.1 Å, представляет собой нитевидный SgrAI WT, содержащий расщепленную ДНК-субстрат, которая обнаруживает ферментативную конфигурацию в конце реакции ферментативного расщепления. Обе структуры содержат фосфатный фрагмент в месте расщепления и биологически значимый кофактор двухвалентного катиона Mg и определяют, как катион Mg реконфигурируется во время ферментативного катализа. Данные подтверждают модель механизма активации, который включает связывание второго Mg в активном сайте SgrAI как прямой результат конформационных изменений, индуцированных филаментацией.

Донг, К., Шэн, К., Геберт, ЛФР, Айер, С., Макрей, И.Дж., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Сборка бактериальной рибосомы с циркулярно перестановленной рРНК. (2024) Исследования нуклеиновых кислот. DOI: 10.1093/nar/gkae636

+ развернуть аннотацию

Котранскрипционная сборка является неотъемлемой особенностью образования РНК-белковых комплексов, опосредующих трансляцию. Что касается синтеза рибосом, предыдущие исследования показали, что строгий порядок транскрипции доменов рРНК может не быть обязательным во время биогенеза бактериальных рибосом, поскольку ряд рРНК с циркулярной перестановкой жизнеспособен. В этой работе мы сообщаем о структурном понимании сборки большой субъединицы бактериальной рибосомы (LSU) на основе карт крио-ЭМ плотности промежуточных продуктов, которые накапливаются во время синтеза рибосом in vitro с использованием набора рРНК с круговой перестановкой (CiPer). Наблюдаемый ансамбль из 23 разделенных промежуточных продуктов больших субъединиц рибосомы обнаруживает консервативные пути сборки с лежащей в основе иерархией среди блоков кооперативной сборки. Существуют сложные взаимозависимости для формирования ключевых структурных спиралей рРНК, выявленных в результате кольцевой перестановки рРНК. Хотя порядок синтеза доменов не является обязательным, порядок ассоциации доменов, по-видимому, имеет определенный порядок, вероятно, из-за сильного эволюционного давления на эффективный синтез рибосом. Эта работа подтверждает надежность известной иерархии сборки бактериальной большой рибосомальной субъединицы и предлагает последовательное представление о том, насколько эффективная сборка CiPer рРНК может быть понята в этом контексте.

Ван Вин, Д., Галаз-Монтойя, Дж.Г., Шен, Л., Болдуин, П., Чаудхари, А.С., Люмкис, Д., Шмид М.Ф., Чиу В., Поли Дж. Недостающее завершение клина из-за обучения без учителя с помощью координатных сетей. (2024) Int J Mol Sci. 25(10). DOI: 10.3390/ijms25105473

+ развернуть аннотацию

Криогенная электронная томография (криоЭТ) — мощный инструмент структурной биологии, позволяющий получать детальные трехмерные изображения биологических образцов с разрешением нанометров. Несмотря на свой потенциал, криоЭТ сталкивается с такими проблемами, как проблема недостающего клина, которая ограничивает качество реконструкции из-за неполных углов сбора данных. Недавно методы контролируемого глубокого обучения, использующие сверточные нейронные сети (CNN), в значительной степени решили эту проблему; однако их требования к предварительной подготовке делают их подверженными неточностям и артефактам, особенно когда репрезентативных данных для обучения недостаточно. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы представляем экспериментальный подход к обучению без учителя с использованием координатных сетей (CN), который оптимизирует веса сети непосредственно на основе входных проекций. Это устраняет необходимость в предварительном обучении, сокращая время реконструкции в 3–3 раз по сравнению с контролируемыми методами. Наши результаты in silico показывают улучшенное завершение формы и уменьшение количества недостающих клиновидных артефактов, что оценивается с помощью нескольких показателей качества изображения на основе вокселей в реальном пространстве и новой метрики направленной корреляции оболочки Фурье (FSC). Наше исследование освещает преимущества и соображения как контролируемого, так и неконтролируемого подходов, направляя разработку улучшенных стратегий реконструкции.

Шэн К., Донг Х., Айер С., Ли Дж., Марквардт С.Д., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Консолидация домена при сборке бактериального 50S, выявленная с помощью зондирования антисмысловых олигонуклеотидов. (2024) биоRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.05.08.593220

+ развернуть аннотацию

Исследование сложной и быстрой кинетики сворачивания крупных РНК-белковых комплексов (РНП), таких как бактериальная рибосома, остается сложной задачей в структурной биологии. Предыдущие генетические подходы к сборке зондов были сосредоточены на модуляции экспрессии либо r-белков, либо факторов сборки. Здесь антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) использовались для разрушения нативных взаимодействий РНК/РНК и РНК/белок с целью создания новых промежуточных продуктов сворачивания. В анализе котранскрипционной сборки было идентифицировано 8 ингибиторов сборки ASO. С помощью криоэлектронной микроскопии были определены 38 новых промежуточных структур, возникающих в результате специфических ингибирований. В частности, новый промежуточный класс предоставил убедительные доказательства независимого сворачивания домена рРНК перед правильным междоменным стыковкой. Три ПНК, нацеленные на домен-I 23S-рРНК, дополнительно разделили ранее идентифицированное ядро сборки на более мелкие блоки, представляющие самые ранние этапы сборки. Полученный граф сборки показывает направленное на матрицу стыковку фолдонов РНК и консолидацию доменов, что обеспечивает иерархическое представление процесса сборки RNP.

Бисвас А., Чоудхури И., Арнольд Э., Люмкис, Д., Холдейн А., Леви Р.М. Кинетические коэволюционные модели предсказывают временное появление мутаций устойчивости к ВИЧ-1 под давлением выбора лекарств. (2024) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 121(15):e2316662121. DOI: 10.1073/pnas.2316662121

+ развернуть аннотацию

Лекарственная устойчивость ВИЧ типа 1 (ВИЧ-1) является широко распространенной проблемой, которая затрагивает жизни миллионов людей во всем мире. Хотя записи о мутациях, устойчивых к лекарствам (DRM), широко сведены в таблицы в общедоступных хранилищах, наше понимание эволюционной кинетики DRM и того, как они развиваются вместе, остается ограниченным. Эпистаз, взаимодействие между DRM и другими остатками в последовательностях белка ВИЧ-1, является ключом к временной эволюции лекарственной устойчивости. Мы используем статистико-энергетическую модель ковариации последовательностей Поттса для приспособленности белка ВИЧ-1 под давлением выбора лекарств, которая фиксирует эпистатические взаимодействия между всеми позициями, в сочетании с кинетическим моделированием эволюционных траекторий последовательностей Монте-Карло, чтобы изучить приобретение DRM по мере того, как они возникают в ансамбле белковых последовательностей пациентов, ранее не принимавших лекарства. Мы следим за динамикой 52 DRM в ферментах протеазе, RT и интегразе, основных мишенях антиретровирусной терапии. Скорость появления DRM сильно коррелирует с наблюдаемой скоростью их приобретения, о которой сообщается в литературе, когда применяется давление лекарств. Этот результат подчеркивает центральную роль эпистаза в определении кинетики, управляющей возникновением DRM. В то время как быстро приобретаемые DRM начинают накапливаться, как только оказывается воздействие препарата, медленно приобретаемые DRM зависят от дополнительных мутаций, которые появляются только после длительного воздействия препарата. Мы предоставляем основу для использования вычислительных методов для определения временной эволюции лекарственной устойчивости с использованием статистических потенциалов Поттса, которые можно использовать для получения механистического понимания путей лекарственной устойчивости ВИЧ-1 и других инфекционных агентов.

Донг, К., Шэн, К., Геберт, ЛФР, Айер, С., Макрей, И.Дж., Люмкис, Д. Сборка бактериальной рибосомы с циркулярно перестановленной рРНК (2024) биоRxiv. DOI: https://doi.org/10.1101/2024.04.10.588894

+ развернуть аннотацию

Котранскрипционная сборка является неотъемлемой особенностью образования РНК-белковых комплексов, опосредующих трансляцию. Что касается синтеза рибосом, предыдущие исследования показали, что строгий порядок транскрипции доменов рРНК может не быть обязательным во время биогенеза бактериальных рибосом, поскольку ряд рРНК с циркулярной перестановкой жизнеспособен. В этой работе мы сообщаем о понимании сборки большой субъединицы бактериальной рибосомы (LSU) на основе карт крио-ЭМ плотности промежуточных продуктов, которые накапливаются во время синтеза рибосом in vitro с использованием набора рРНК с круговой перестановкой (CiPer). Наблюдаемый ансамбль из двадцати трех разделенных промежуточных продуктов больших субъединиц рибосомы обнаруживает консервативные маршруты сборки с базовой иерархией среди блоков совместной сборки. Существуют сложные взаимозависимости для формирования ключевых структурных спиралей рРНК, выявленных в результате круговой перестановки рРНК. Хотя порядок синтеза доменов не является обязательным, порядок ассоциации доменов, по-видимому, имеет определенный порядок, вероятно, из-за сильного эволюционного давления на эффективный синтез рибосом. Эта работа подтверждает надежность известной иерархии сборки бактериальной большой рибосомальной субъединицы и предлагает целостное представление о том, насколько эффективная сборка CiPer рРНК может быть понята в этом контексте.

+ развернуть аннотацию

Криогенная электронная томография (криоЭТ) — мощный инструмент структурной биологии, позволяющий получать детальные трехмерные изображения биологических образцов с разрешением нанометров. Несмотря на свой потенциал, криоЭТ сталкивается с такими проблемами, как проблема недостающего клина, которая ограничивает качество реконструкции из-за неполных углов сбора данных. Недавно методы контролируемого глубокого обучения, использующие сверточные нейронные сети (CNN), в значительной степени решили эту проблему; однако их требования к предварительной подготовке делают их подверженными неточностям и артефактам, особенно когда репрезентативных данных для обучения недостаточно. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы представляем экспериментальный подход к обучению без учителя с использованием координатных сетей (CN), который оптимизирует веса сети непосредственно на основе входных проекций. Это устраняет необходимость в предварительном обучении, сокращая время реконструкции в 3–3 раз по сравнению с контролируемыми методами. Наши результаты показывают улучшенное завершение формы и уменьшение количества недостающих клиновидных артефактов, что оценивается с помощью нескольких показателей качества изображения на основе вокселей в реальном пространстве и новой метрики направленной корреляции оболочки Фурье (FSC). Наше исследование освещает преимущества и соображения как контролируемого, так и неконтролируемого подходов, направляя разработку улучшенных стратегий реконструкции.

Айер, С., Болдуин, П.Р., Тан, С.М., Шан, З., О, Дж., Мехрани, А., Боуман, М.Э., Луи, Г., Пассос, Д.О., Джорджевич-Марквардт, С., Мицш, М., Халл Дж.А., Хошика С., Барад Б.А., Гротьян Д.А., МакКенна Р., Агбандже-МакКенна М., Беннер С.А., Ноэль Дж.А.П., Ван Д., Тан И.З., Люмкис, Д. Преодоление снижения разрешения при сборе данных крио-ЭМ под наклоном. (2024) Природа связи. 15(1):389. DOI: 10.1038/s41467-023-44555-7

+ развернуть аннотацию

Усилия в области структурной биологии с использованием криогенной электронной микроскопии часто подавляются из-за того, что образцы принимают «предпочтительную ориентацию» на сетках, что приводит к анизотропному разрешению карт и затрудняет определение структуры. Наклон предметного столика во время сбора данных является обобщающим решением, но исторически приводил к существенному снижению разрешения. Здесь мы разрабатываем обновленные рабочие процессы сбора данных и обработки изображений и демонстрируем на нескольких образцах, что снижение разрешения незначительно или значительно снижается в зависимости от угла наклона. Реконструкции с наклоном сцены до 60° и без нее практически неотличимы. Эти стратегии позволили реконструировать с разрешением 3 Å бактериальную РНК-полимеразу с предпочтительной ориентацией, содержащую неприродный нуклеотид, для изучения распознавания новых пар оснований. Кроме того, мы представляем количественную основу, которая позволяет специалистам по крио-ЭМ определять оптимальный угол наклона во время сбора данных. Эти результаты подтверждают полезность использования наклона столика для сбора данных и предоставляют количественные показатели для получения изотропных карт.

Сан К., Бисвас А., Люмкис, Д., Леви Р., Дэн Н. Выяснение молекулярных детерминант способов связывания ингибитора переноса цепи интегразы ВИЧ-1 третьего поколения: важность реорганизации боковой цепи и растворителя. (2024) Вирусы. 16(1). DOI: 10.3390/v16010076

+ развернуть аннотацию

Клинически используемые ингибиторы переноса цепи интегразы ВИЧ-1 (ИН) (INSTI) первого и второго поколения являются ключевыми компонентами антиретровирусной терапии (АРТ), которые действуют путем блокирования этапа интеграции в цикле репликации ВИЧ-1, который катализируется нуклеопротеиновая сборка, называемая интасомой. Однако начинает проявляться устойчивость даже к новейшим клинически используемым INSTI. Развивающиеся INSTI третьего поколения, основанные на нафтиридиновых каркасах, являются многообещающими кандидатами для борьбы с лекарственно-устойчивыми вариантами вируса. Среди этих новых INSTI соединение демонстрирует две различные конформации при связывании с интасомами ВИЧ-1 и близкородственным прототипом пенистого вируса (PFV), несмотря на высокое структурное сходство их карманов связывания INSTI. Молекулярный механизм и ключевые остатки активного центра, ответственные за эти различные способы связывания в близкородственных интасомах, остаются неясными. Чтобы раскрыть молекулярные детерминанты, управляющие двумя различными режимами связывания, мы применили новый метод свободной энергии, основанный на молекулярной динамике, который использует алхимические пути для преодоления проблем отбора проб, связанных с переходом между двумя связанными конформациями лиганда в густонаселенной среде связывания INSTI. карманы в этих интасомах. Рассчитанные конформационные свободные энергии успешно повторяют экспериментально наблюдаемые предпочтения режима связывания в двух вирусных интасомах. Анализ смоделированных структур показывает, что наблюдаемые предпочтения режима связывания вызваны различиями аминокислотных остатков как в переднем, так и в центральном каталитическом субкармане сайта связывания INSTI в ВИЧ-1 и PFV. Дополнительные расчеты свободной энергии на мутантах ВИЧ-1 и PFV показали, что, хотя оба субкармана способствуют выбору режима связывания, центральный субкарман играет более важную роль. Эти результаты подчеркивают важность реорганизации как боковой цепи, так и растворителя, а также конформационной энтропии при определении режима связывания лиганда и помогут разработать более эффективные INSTI для борьбы с лекарственно-устойчивыми вирусными вариантами.

Цзин, Т., Шан, З., Динь, Т., Бисвас, А., Чан, С., Гринвуд, Дж., Ли, М., Чжан, З., Грей, Г., Шин, Х.Дж., Чжоу , Б., Пассос Д., Айер С., Ли З., Крейги Р., Энгельман А.Н., Кварацхелия М., Люмкис, Д. Олигомерные структуры интегразы ВИЧ-1 демонстрируют функциональную пластичность при сборке интасом и связывании РНК. (2024) биоRxiv. DOI: 10.1101 / 2024.01.26.577436

+ развернуть аннотацию

Интеграза (IN) выполняет двойную важную роль во время репликации ВИЧ-1. Во время проникновения ИН функционирует в составе олигомерной сборки «интасома», катализируя интеграцию вирусной ДНК в хроматин хозяина. На поздних стадиях инфекции тетрамерный ИН связывает вирусную РНК и организует конденсацию рибонуклеопротеиновых комплексов в ядро капсида. Молекулярная архитектура сборок IN ВИЧ-1, которые опосредуют эти отдельные события, остается неизвестной. Более того, тетрамер является важной противовирусной мишенью для аллостерических ингибиторов ИН. Здесь мы определили крио-ЭМ-структуры тетрамеров IN ВИЧ-1 дикого типа и гексадекамеров интасомы. Наши структуры демонстрируют замечательную пластичность, которая позволяет использовать IN-C-концевые домены и примыкающие к ним линкеры для сборки функционально различных олигомерных форм. Изменение недавно обнаруженного консервативного интерфейса показало, что обе функции IN отслеживаются при тетрамеризации и во время инфекции ВИЧ-1. В совокупности наши результаты показывают, как пластичность ИН управляет его разнообразными молекулярными функциями, предлагают рабочую модель связывания ИН-вирусной РНК и предоставляют атомные схемы для разработки аллостерических ингибиторов ИН.

Хаак Д.Б., Рудольфс Б., Чжан К., Люмкис, Д., Тоор, Н. Структурные основы ветвления при сплайсинге РНК. (2023) Структурная и молекулярная биология природы. DOI: 10.1038/s41594-023-01150-0

+ развернуть аннотацию

Ветвление является критическим этапом сплайсинга РНК, который необходим для выбора 5'-сайта сплайсинга. Недавние структуры сплайсосом привели к созданию конкурирующих моделей распознавания инвариантного аденозина в точке ветвления. Однако не существует структур какого-либо комплекса сплайсинга с аденозиновым нуклеофилом, пристыкованным к активному сайту и расположенным для атаки 5'-сайта сплайсинга. Таким образом, нам не хватает механистического понимания отбора аденозина и распознавания сайтов сплайсинга во время сплайсинга РНК. Здесь мы представляем криоэлектронную микроскопическую структуру интрона группы II, которая показывает, что динамика активного центра связана с образованием тройки оснований внутри спирали сайта ветвления, которая позиционирует 2'-OH аденозина для нуклеофильной атаки на 5'-расщепляющийся фосфат. Эта структура, дополненная биохимическими и сравнительными анализами сплайсинговых комплексов, поддерживает базовую тройную модель распознавания аденозина для ветвления внутри интронов группы II и эволюционно родственных сплайсосом.

О, Дж., Шан, З., Хошика, С., Сюй, Дж., Чонг, Дж., Беннер, С.А., Люмкис, Д., Ван, Д. Единая геометрия Уотсона-Крика управляет транскрипцией шестибуквенных расширенных алфавитов ДНК с помощью РНК-полимеразы E. coli. (2023) Природа связи. 14(1):8219. DOI: 10.1038/s41467-023-43735-9

+ развернуть аннотацию

Искусственно расширенные генетические информационные системы (AEGIS) добавляют независимо реплицируемые пары неприродных нуклеотидов к естественным парам G:C и A:T/U, обнаруженным в нативной ДНК, соединяя неестественные пары посредством альтернативных способов водородных связей. Остается неизвестным, распознаются ли и обрабатываются ли пары AEGIS многосубъединичными клеточными РНК-полимеразами (РНКП) и каким образом. Здесь мы показываем, что РНКП E. coli избирательно распознает неестественные нуклеиновые основания в шестибуквенной расширенной генетической системе. Крио-ЭМ-структуры трех комплексов элонгации РНКП с высоким разрешением, содержащих UBP матрица-субстрат, раскрывают общие принципы распознавания AEGIS и природных пар оснований. В этих структурах РНКП захватываются в активном состоянии и готовы выполнить химический этап. В этот момент неестественная пара оснований принимает геометрию Уотсона-Крика, а триггерная петля сворачивается в активную конформацию, что указывает на то, что механистические принципы, лежащие в основе распознавания и включения естественных пар оснований, также применимы к неестественным парам оснований AEGIS. Эти данные подтверждают философию создания неестественных пар оснований AEGIS. Кроме того, мы предоставляем структурные доказательства, подтверждающие давнюю гипотезу о том, что несовпадение пар во время транскрипции происходит посредством таутомеризации. Наша совместная работа подчеркивает важность взаимодополняемости Уотсона-Крика, лежащей в основе принципов проектирования распознавания пар оснований AEGIS.

Се, Л., Боуман, М.Э., Луи, Г.В., Чжан, К., Ардеяни, М.С., Хуанг, К., Чу, К., Дональдсон, СиДжей, Вон, Дж.М., Шан, Х., Пауэрс, Э.Т., Келли , ЙВ, Люмкис, Д., Ноэль Дж.П., Сагателян А. Биохимия и белковые взаимодействия микропротеина CYREN. (2023) Биохимия. DOI: 10.1021/acs.biochem.3c00397.

+ развернуть аннотацию

За последнее десятилетие достижения в области геномики выявили тысячи дополнительных малых открытых рамок считывания (smORF), кодирующих белки, которые были упущены традиционными подходами к поиску генов. Эти smORF кодируют пептиды и небольшие белки, обычно называемые микропептидами или микропротеинами. Некоторые из этих недавно открытых микропротеинов выполняют биологические функции и действуют посредством взаимодействия с белками и белковыми комплексами внутри клетки. CYREN1 представляет собой охарактеризованный микропротеин, который регулирует восстановление двухцепочечных разрывов в клетках млекопитающих посредством взаимодействия с гетеродимером Ku70/80. Ku70/80 связывается и стабилизирует двухцепочечные разрывы и задействует механизмы, необходимые для восстановления негомологичных концевых соединений. В этом исследовании мы изучили биохимические свойства CYREN1, чтобы лучше понять и объяснить его взаимодействия с клеточными белками. Наши результаты подтверждают, что CYREN1 по своей сути является неупорядоченным микробелком, и эта неупорядоченная структура позволяет ему обогащать несколько белков, включая недавно обнаруженное взаимодействие с SF3B1 посредством отчетливого короткого линейного мотива (SLiM) на CYREN1. Поскольку предполагается, что многие микропротеины неупорядочены, CYREN1 является примером того, как микропротеины взаимодействуют с другими белками, и раскрывает неизвестную функцию каркаса этого микропротеина, которая может связывать NHEJ и сплайсинг.

Шэн К., Ли Н., Рабак-Гиббонс Дж. Н., Донг X., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Пейзаж сборки большой рибосомальной субъединицы бактерий. (2023) Природа связи. 14(1):5220. DOI: 10.1038/s41467-023-40859-w

+ развернуть аннотацию

Сборка рибосом у бактерий очень эффективна и занимает ~2-3 минуты, но это делает количество промежуточных продуктов сборки очень низким, что представляет собой проблему для понимания механизма. Генетические нарушения процесса сборки создают узкие места, где накапливаются промежуточные соединения, что облегчает структурную характеристику. Мы используем криоэлектронную микроскопию с итеративной субклассификацией для идентификации промежуточных продуктов сборки рибосомальной субъединицы 50S из E. coli. Анализ ансамбля промежуточных продуктов, охватывающего весь путь биогенеза субъединицы 50 S, был облегчен с помощью подхода уменьшения размерности и выбора кластеров с использованием PCA-UMAP-HDBSCAN. Выявлена идентичность кооперативных единиц сворачивания РНК с ассоциированными белками, а иерархия этих единиц раскрывает полную карту сборки всех РНК и белковых компонентов. Сборка обычно происходит котранскрипционно, с некоторой гибкостью ландшафта, чтобы гарантировать эффективность этого центрального клеточного процесса в различных условиях роста.

Ли, М., Оливейра Пассос, Д., Шан, З., Смит, С.Дж., Сун, К., Бисвас, А., Чоудхури, И., Струценберг, Т.С., Холдейн, А., Денг, Н., Ли , Z., Zhao, XZ, Briganti, L., Kvaratskhelia, M., Burke, TR, Levy, RM, Hughes, SH, Craigie, R., Люмкис, Д. Механизмы устойчивости интегразы ВИЧ-1 к долутегравиру и сильное ингибирование лекарственно-устойчивых вариантов. (2023) Научные достижения 9(29):eadg5953. DOI: 10.1126/sciadv.adg5953

+ развернуть аннотацию

Донг X., Дерфель Л.К., Шэн К., Рабак-Гиббонс Дж.Н., Попова А.М., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Почти физиологическая сборка 50S рибосом in vitro включает параллельные пути. (2023) Исследования нуклеиновых кислот. DOI: 10.1093/нар/gkad082

+ развернуть аннотацию

Понимание принципов сборки биологических макромолекулярных комплексов остается серьезной проблемой из-за сложности систем и трудностей в разработке экспериментальных подходов. В качестве рибонуклеопротеинового комплекса рибосома служит модельной системой для профилирования сборки макромолекулярного комплекса. В этой работе мы сообщаем о множестве промежуточных структур больших рибосомальных субъединиц, которые накапливаются во время синтеза в почти физиологической и ко-транскрипционной системе восстановления in vitro. Тринадцать промежуточных карт до 50S, охватывающих весь процесс сборки, были разрешены с использованием крио-ЭМ анализа отдельных частиц и гетерогенной подклассификации. Сегментация набора карт плотности показывает, что промежуточные соединения 50S рибосом собираются на основе четырнадцати кооперативных блоков сборки, включая наименьшее ядро сборки, известное на сегодняшний день, которое состоит из свернутой рРНК длиной 600 нуклеотидов и трех рибосомных белков. Кооперативные блоки собираются в ядро сборки в соответствии с определенными зависимостями, обнаруживая параллельные пути как на ранней, так и на поздней стадиях сборки субъединицы 50S.

Люмкис, Д., Хортон, Северная Каролина Роль филаментации в активации и специфичности последовательности ДНК сиквенс-специфичной эндонуклеазы SgrAI. (2022) Труды биохимического общества. DOI: 10.1042/BST20220547

+ развернуть аннотацию

Образование филаментов метаболическими, биосинтетическими и другими ферментами недавно привлекло внимание как механизм точной настройки активности ферментов в клетке. Филаментация является ключом к функции SgrAI, специфичной к последовательности ДНК-эндонуклеазы, которая служит модельной системой для обеспечения некоторых из самых глубоких сведений о биофизических характеристиках филаментации и ее функциональных последствиях. Структурно-функциональный анализ показывает, что в нитевидном состоянии SgrAI стабилизирует конформацию активированного фермента, что приводит к ускоренной активности расщепления ДНК и расширенной специфичности последовательности ДНК. Последнее, как полагают, опосредовано специфичной для последовательности структурой ДНК, взаимодействиями белок-ДНК и переходом от беспорядка к порядку в белке, которые в совокупности влияют на относительную стабильность неактивной, ненитевидной конформации и активной, нитевидной конформации. конформация SgrAI, связанного с ДНК. Полное глобальное кинетическое моделирование пути расщепления ДНК показывает медленную, ограничивающую скорость, константу скорости ассоциации второго порядка для сборки филаментов, а моделирование активности in vivo предсказывает, что филаментация превосходит нефиламентные механизмы в обеспечении быстрой активации и секвестрации филаментов. Активность SgrAI по расщеплению ДНК на ДНК фага и на удалении от хромосомы хозяина. Исследования in vivo демонстрируют критическую необходимость ускоренного расщепления ДНК с помощью SgrAI в его биологической роли для защиты бактериального хозяина. В совокупности эти данные продвинули наше понимание того, как филаментация может регулировать структуру и функцию фермента, в то время как экспериментальные стратегии, используемые для SgrAI, могут быть применены к другим ферментативным системам для определения новых функциональных ролей для филаментации.

Шэн К., Ли Н., Рабак-Гиббонс Дж. Н., Дин X., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Неконтролируемая сегментация на основе вокселей выявляет ландшафт ранней сборки бактериальной рибосомной крупной субъединицы (2022) биоРив. DOI: https://doi.org/10.1101/2022.11.09.515851

+ развернуть аннотацию

Биогенез рибосом — сложный, но эффективный процесс у быстрорастущих бактерий, где сборка функциональной 70S рибосомы занимает ~ 2 мин с участием 3 рРНК, 50 r-белков и десятков факторов сборки. Реконструкция in vitro с использованием различных подмножеств белков больших субъединиц (50S, LSU) с рРНК, впервые разработанная лабораторией Nierhaus, привела к карте сборки Nierhaus, воплощающей кооперативность и зависимость связывания r-белков LSU с 23S рРНК. На карте Нирхауса критически отсутствует лежащий в основе фолдинг рРНК, который создает сайты связывания для r-белков. Кроме того, связь наблюдаемой кооперативности in vitro с ко-транскрипционной сборкой в клетках еще предстоит определить. Промежуточные соединения пре-50S накапливаются при низкой температуре в ΔdeaD, геликазе DEAD-box, участвующей в сборке 50S. Мы решили 21 карту плотности до 50S из фракций, содержащих промежуточные продукты, с помощью крио-ЭМ. В недавно решенных картах мы обнаружили самый ранний промежуточный продукт из когда-либо зарегистрированных, состоящий из домена I на 5'-конце 23S рРНК. Чтобы исследовать механизм карт во время сборки, мы разработали новый метод сегментации карты плотности и анализа зависимостей. В результате сегментации карт было идентифицировано десять блоков совместной сборки, которые были организованы в карту зависимости блоков. Это первый раз, когда зависимость от сворачивания спиралей рРНК и связывания рибосомных белков может быть интегрирована в полную карту сборки. Кроме того, мы показали, как выходной туннель складывается со стороны растворителя, служащий каркасом для созревания 50S. Используя этот новый метод анализа сегментации, мы пересмотрели ранее сообщавшиеся наборы данных об истощении bL17 и ΔsrmB. Что наиболее примечательно, два других набора данных также согласуются с блочной зависимостью, что подразумевает единый путь ранней сборки и гибкий ландшафт созревания в начале биогенеза 50S.

Юзвик И.К., Ли В., Чжан Д.В., Вонг Д., Гравенхофф Дж., Балландрас-Колас А., Айер С., Черепанов П., Энгельман А.Н., Люмкис, Д. Переход B-to-A в ДНК-мишени во время ретровирусной интеграции. (2022) Исследования нуклеиновых кислот. DOI: 10.1093/нар/gkac644

+ развернуть аннотацию

Интеграция в ДНК-мишень хозяина (тДНК), отличительный признак ретровирусной репликации, опосредуется интасомой, мультимером интегразы (IN), собранным на концах вирусной ДНК (вДНК). Чтобы выяснить аспекты распознавания тДНК во время интеграции, мы решили крио-ЭМ-структуру с разрешением 3.5 Å интасомы комплекса переноса цепи (STC) вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV). ТДНК принимает А-подобную конформацию в области, охватывающей места соединения вДНК, что обнажает сахаро-фосфатный остов для IN-опосредованного переноса цепи. Исследование существующих ретровирусных структур STC выявило сохранение тДНК А-формы в аналогичных участках этих комплексов. Более того, анализ предпочтений последовательностей в сайтах геномной интеграции, на которые избирательно нацелены шесть различных ретровирусов, выявил постоянную склонность к А-фильным последовательностям в сайтах присоединения вДНК. Наша структура дополнительно выявила несколько новых взаимодействий MMTV IN-ДНК, а также контакты, наблюдаемые в предшествующих структурах STC, включая консервативные остатки Pro125 и Tyr149, взаимодействующие с тДНК. В инфицированных клетках замены Pro125 влияли на глобальный паттерн интеграции MMTV без значительного изменения предпочтений локальной последовательности оснований в сайтах встраивания вДНК. В совокупности эти данные улучшают наше понимание структуры и функции ретровирусных интасом, а также факторов, влияющих на паттерны интеграции вДНК в геномную ДНК.

Харрисон, Дж.ЖЕК, Оливейра Пассос, Д., Брюн, Дж.Ф., Бауман, Дж.Д., Туберти, Л., ДеСтефано, Дж.Дж., Ксавьер Руис, Ф., Люмкис, Д., Арнольд, Э. Крио-ЭМ-структура полипротеина Pol ВИЧ-1 дает представление о созревании вириона (2022) Научные достижения DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.abn9874.

+ развернуть аннотацию

Айер, С., Струценберг, Т.С., Боуман, М.Э., Ноэль, Дж.П., Люмкис, Д. Сбор данных Cryo-EM для отдельных частиц с наклоном столика с использованием Leginon. (2022) Юпитер.(185) ДОИ: 10.3791/64136

+ развернуть аннотацию

Анализ отдельных частиц (SPA) с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) в настоящее время является основным методом структурной биологии с высоким разрешением. Определение структуры с помощью SPA основано на получении нескольких различных изображений макромолекулярного объекта, застеклованного в тонком слое льда. В идеале набор равномерно распределенных случайных ориентаций проекций должен составлять все возможные виды объекта, что приводит к реконструкциям, характеризующимся изотропным разрешением по направлениям. Однако в действительности многие образцы страдают от преимущественно ориентированных частиц, прилипающих к границе раздела воздух-вода. Это приводит к неравномерному распределению угловой ориентации в наборе данных и неоднородной дискретизации в пространстве Фурье при реконструкции, переводящейся в карты, характеризующиеся анизотропным разрешением. Наклон предметного столика обеспечивает универсальное решение для преодоления анизотропии разрешения за счет улучшения однородности распределения ориентации и, следовательно, изотропии дискретизации пространства Фурье. Настоящий протокол описывает стратегию автоматизированного сбора данных с наклонной стадией с использованием Leginon, программного обеспечения для автоматического получения изображений. Процедура проста в реализации, не требует дополнительного оборудования или программного обеспечения и совместима с большинством стандартных просвечивающих электронных микроскопов (ПЭМ), используемых для визуализации биологических макромолекул.

Балландрас-Колас, А., Чивукула, В., Грушка, Д.Т., Шан, З., Сингх, П.К., Пай, В.Е., Маклин, Р.К., Бедвелл, Г.Дж., Ли, В., Нанс, А., Кук, Нью-Джерси , Fadel, HJ, Poeschla, EM, Griffiths, DJ, Vargas, J., Taylor, IA, Люмкис, Д., Ярдымчи Х., Энгельман А.Н., Черепанов П. Многовалентные взаимодействия необходимы для функции лентивирусной интегразы. (2022) Природа связи. 13(1):2416. DOI: 10.1038/s41467-022-29928-8

+ развернуть аннотацию

Мультимер ретровирусной интегразы (IN) синапсирует вирусную ДНК на концах внутри стабильного интасомного нуклеопротеинового комплекса для интеграции в геном клетки-хозяина. Восстановление интасомы вируса меди-висна (MVV), лентивируса овец, выявило большую сборку, содержащую шестнадцать субъединиц IN. Здесь мы сообщаем о крио-ЭМ-структурах лентивирусной интасомы до взаимодействия с ДНК-мишенью и после переноса цепи, уточненных с разрешением 3.4 и 3.5 Å соответственно. Структуры проясняют детали интерфейсов белок-белок и белок-ДНК, участвующих в формировании лентивирусных интасом. Мы показываем, что гомомерные интерфейсы, участвующие в образовании гексадекамера IN, и α-спиральная конфигурация линкера, соединяющего C-концевой и каталитический домены ядра, имеют решающее значение для активности переноса цепи IN MVV in vitro и для инфекционности вируса. Одномолекулярная микроскопия в сочетании с фотообесцвечиванием показывает, что интасома MVV может связывать переменное количество, до шестнадцати молекул, лентивирус-специфического фактора-хозяина LEDGF/p75. Соответственно, удаление эндогенного LEDGF/p75 приводит к значительному перераспределению сайтов интеграции MVV в клетках человека и овцы. Наши данные подтверждают важность расширенной архитектуры, наблюдаемой в крио-ЭМ исследованиях лентивирусных интасом, и позволяют предположить, что эта организация лежит в основе поливалентных взаимодействий с хроматином для нацеливания интеграции на активные гены.

Хортон Н., Гадириан Н., Шан З., Люмкис, Д. Механизм активации SgrAI посредством филаментации фермента и механизм расширения специфичности последовательности ДНК. (2022) Журнал ФАСЭБ. 36 Suppl 1: ЭТО ТОЛЬКО РЕЗЮМЕ. DOI: 10.1096/fasebj.2022.36.S1.0R839

+ развернуть аннотацию

Мы описываем новую крио-ЭМ-структуру 2.7 Å филаментообразующего фермента, SgrAI, в предпереходном состоянии, захваченном непосредственно перед нуклеофильной атакой. Ферменты, образующие филаменты, представляют собой ферменты, образующие линейные, спиральные и даже трубчатые структуры, которые могут действовать, регулируя активность ферментов, играть роль в передаче сигналов, зародышевых фазах, разделенных безмембранными клеточными компартментами, или выполнять другие возможные функции. SgrAI представляет собой ДНК-эндонуклеазу, специфичную к последовательности, которая играет роль в бактериальном врожденном иммунитете. Гонка вооружений фаг-хозяин, возможно, является старейшей коэволюционной системой, в которой бактерии развивают системы для защиты от вторжения ДНК, а фаги развивают системы, чтобы перехитрить бактериальную защиту. SgrAI образует филаменты с левосторонней спиральной симметрией, состоящей из четырех копий на виток, которые в принципе могут удлиняться бесконечно. Кинетика ассоциации и диссоциации филамента и концентрации ДНК-связанного SgrAI ограничивают размер филамента в лабораторных условиях до 2-20 копий фермента, а количество сайтов узнавания на фаговом геноме ограничивает размер филамента in vivo. Филаментация активирует константу скорости SgrAI для расщепления ДНК в 200-1000 раз, а также расширяет специфичность последовательности ДНК SgrAI, включая четырнадцать дополнительных последовательностей распознавания. Наша предыдущая работа показала детали нитевидной архитектуры, конформационные изменения в связанной ДНК и белке, а также полный ферментативный кинетический путь, включая микроскопические константы скорости для каждого шага. Эти исследования предполагают, что необычный регуляторный механизм, включающий филаментацию, развился в SgrAI, чтобы максимизировать его антифаговую активность, защищая необычно длинный геном его хозяина от повреждения разрывов ДНК. Наша новая структура связывает конформационные изменения, наблюдаемые в SgrAI в нитевидной форме, со связыванием второго двухвалентного катиона в активном центре, что приводит к наблюдаемой скорости расщепления активированной ДНК. В сочетании с недавно опубликованной рентгеновской кристаллической структурой апо SgrAI мы предлагаем механизмы расширения специфичности последовательности ДНК при филаментации, включая переход от беспорядка к порядку, энергетику структуры ДНК и взаимодействия белок-ДНК.

Рабак-Гиббонс, Дж. Н., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Количественный анализ композиционной неоднородности в наборах крио-ЭМ данных промежуточных продуктов сборки рибосом. (2022) Структура. DOI: 10.1016/j.str.2021.12.005

+ развернуть аннотацию

Криоэлектронная микроскопия отдельных частиц (крио-ЭМ) предлагает уникальную возможность охарактеризовать структурную неоднородность макромолекул благодаря своей способности помещать отдельные популяции частиц в разные группы посредством компьютерной классификации. Однако существует нехватка инструментов для изучения ландшафта неоднородности, количественного анализа популяций гетерогенных частиц после классификации, определения того, сколько уникальных классов представлено данными, и точного перекрестного сравнения реконструкций. Здесь мы разрабатываем рабочий процесс, который содержит модули обнаружения и анализа для количественного анализа данных крио-ЭМ для наборов структур с максимальным разнообразием. Этот рабочий процесс был применен к набору данных промежуточных продуктов сборки 50S рибосом E. coli, которые характеризуются значительной структурной гетерогенностью. Мы определили более подробные точки ветвления в процессе сборки и охарактеризовали взаимодействие фактора сборки с незрелыми промежуточными продуктами. Хотя описанные здесь инструменты были разработаны для сборки рибосом, они должны быть широко применимы к анализу других гетерогенных наборов данных крио-ЭМ.

Шан З., Гадирян Н., Люмкис, Д., Хортон, Северная Каролина Предпереходное состояние и апо-структуры филаментообразующего фермента SgrAI объясняют механизмы активации и специфичность субстрата. (2022) Журнал биологической химии.:101760 DOI: 10.1016/j.jbc.2022.101760

+ развернуть аннотацию

Ферментативная филаментация является широко распространенным явлением, которое опосредует регуляцию и функцию ферментов. Для филаментообразующей последовательности ДНК-эндонуклеазы SgrAI процесс филаментации ускоряет ее активность по расщеплению ДНК и расширяет специфичность ее последовательности ДНК, что позволяет быстро расщеплять многие дополнительные последовательности ДНК. Предполагается, что оба исхода — ускорение расщепления ДНК и расширение специфичности последовательности — регулируют критические процессы бактериального врожденного иммунитета. Однако механистические основы, лежащие в основе этих событий, остаются неясными. Здесь мы описываем две новые структуры фермента SgrAI, которые проливают свет на его каталитическую функцию. Во-первых, мы представляем крио-ЭМ-структуру нитевидного SgrAI, связанного с интактной ДНК первичного сайта, и Ca, разрешенного до ~ 2.5 Å внутри каталитического центра, который представляет собой захваченный комплекс фермент / ДНК до реакции расщепления ДНК. Эта структура обнаруживает важные конформационные изменения, которые способствуют каталитическому механизму и связыванию второго двухвалентного катиона в активном центре фермента, что, как ожидается, способствует повышенной активности расщепления ДНК SgrAI в нитевидном состоянии. Во-вторых, мы представляем рентгеновскую кристаллическую структуру без ДНК (апо) SgrAI с разрешением 2.0 Å, которая показывает неупорядоченную петлю, участвующую в распознавании ДНК. В совокупности эти многочисленные новые наблюдения проясняют механизм расширения специфичности последовательности ДНК SgrAI, включая косвенное считывание зависимой от последовательности структуры ДНК, изменения во взаимодействиях белок-ДНК и переход от беспорядка к порядку ключевого элемента распознавания ДНК. .

Пассос Д.О., Ли М., Крейги Р., Люмкис, Д. Глава книги - Ретровирусная интеграза: структура, механизм и ингибирование (2021) Ферменты. 50:249-300. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.enz.2021.06.007

+ развернуть аннотацию

Ретровирусный белок интеграза (IN) катализирует согласованную интеграцию вирусной ДНК в хроматин хозяина, чтобы установить постоянную инфекцию в клетке-мишени. Мы многое узнали о механизме каталитической интеграции благодаря изучению структуры/функции за предыдущие четыре десятилетия исследований IN. Как один из трех основных ретровирусных ферментов, IN также используется антиретровирусными препаратами для лечения ВИЧ-инфицированных. Ингибиторы, блокирующие каталитическую реакцию интеграции, в настоящее время являются современными препаратами в наборе инструментов антиретровирусной терапии. IN ВИЧ-1 также выполняет интригующие некаталитические функции, которые имеют отношение к поздним стадиям цикла репликации вируса, однако этот аспект остается плохо изученным. Существуют также новые аллостерические ингибиторы, нацеленные на неферментативные функции IN, которые вызывают блокировку на поздних стадиях цикла репликации вируса. В этой главе мы обсудим функцию, структуру и ингибирование ретровирусных белков IN, выделив оставшиеся проблемы и нерешенные вопросы.

Люмкис, Д. Глава книги: Предпочтительная ориентация. Как распознать и справиться с неблагоприятными последствиями. (2021) Одночастичная крио-ЭМ биологических макромолекул. DOI: 10.1088/978-0-7503-3039-8

Смит С.Дж., Чжао XZ, Пассос Д.О., Пай В.Е., Черепанов П., Люмкис, Д., Берк, Т.Р., Хьюз, С.Х. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 с модификациями, влияющими на их эффективность в отношении устойчивых к лекарственным средствам мутантов интегразы. (2021) АСУ Инфекция Дис. DOI: 10.1021/acsinfecdis.0c00819

+ развернуть аннотацию

Ингибиторы переноса цепи интегразы (INSTI) блокируют этап интеграции ретровирусного жизненного цикла и являются препаратами первой линии, используемыми для лечения ВИЧ-1/СПИДа. INSTI имеют полициклическое ядро с триадами гетероатомов, хелатируют ионы металлов в активном центре и имеют галобензильную группу, которая взаимодействует с вирусной ДНК, присоединенной к ядру с помощью гибкого линкера. Наиболее широко эффективные INSTI ингибируют как интегразу дикого типа (WT) (IN), так и ряд хорошо известных мутантов. Однако, поскольку существуют мутации, которые снижают эффективность всех доступных INSTI, необходимы новые и лучшие соединения. Модели, основанные на недавних структурах SIV IN ВИЧ-1 и красношапочного мангабая, предполагают модификации в структурах INSTI, которые могут усилить взаимодействие с 3'-концевым аденозином вирусной ДНК, что может улучшить эффективность против мутантов, устойчивых к INSTI. Мы разработали и протестировали серию INSTI с модификациями нафтиридинового каркаса. Одно из новых соединений сохраняло хорошую эффективность против расширенной панели мутантов ВИЧ-1 IN, которые мы тестировали. Наши результаты предполагают возможность разработки ингибиторов, сочетающих в себе лучшие свойства существующих соединений, которые могут обеспечить дополнительную эффективность против известных мутантов ВИЧ-1 IN.

Смит, SJ, Чжао, XZ, Пассос, Д.О., Люмкис, Д., Берк, Т.Р., Хьюз, С.Х. Ингибиторы переноса цепи интегразы являются эффективными препаратами против ВИЧ. (2021) Вирусы. 13(2). DOI: 10.3390/v13020205

+ развернуть аннотацию

Айер С., Чжан С., Болдуин П.Р., Люмкис, Д. Оценка локального и направленного разрешения крио-ЭМ карт плотности. (2020) Методы молекулярной биологии. 2215:161-187. DOI: 10.1007/978-1-0716-0966-8_8

+ развернуть аннотацию

Юзвик, И.К., Пассос, Д.О., Люмкис, Д. Структурная биология ингибиторов переноса цепи интегразы ВИЧ. (2020) Тенденции в фармакологических науках. DOI: 10.1016/j.tips.2020.06.003

+ развернуть аннотацию

Болдуин, PR, Люмкис, Д. Средства визуализации и анализа дискретизации пространства Фурье в крио-ЭМ. (2020) Прогресс в биофизике и молекулярной биологии. DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2020.06.003

+ развернуть аннотацию

Полное понимание того, как распределение ориентации способствует реконструкции крио-ЭМ, по-прежнему отсутствует. Необходимо начать критически оценивать набор точек зрения, чтобы понять его влияние на экспериментальные реконструкции. С этой целью мы недавно предположили, что тип распределения ориентации может систематически изменять меры разрешения. Мы ввели коэффициент компенсации дискретизации (SCF), который включает в себя то, как геометрия коллекции может изменить спектральное отношение сигнал/шум (SSNR), независимо от других экспериментальных аспектов. Здесь мы показываем, что знание выборки, ограниченной сферическими поверхностями достаточно больших радиусов в пространстве Фурье, эквивалентно знанию множества проекций. Более того, геометрический фактор СКФ может быть рассчитан по одной такой поверхности. Чтобы помочь исследователям крио-ЭМ, мы разработали инструмент с графическим пользовательским интерфейсом (GUI), который оценивает экспериментальные распределения ориентации. Графический пользовательский интерфейс возвращает графики направлений проекций, выборки, ограниченной поверхностью сферы, значение SCF, долю пустой области пространства Фурье и гистограмму значений выборки по точкам на сфере. Наконец, можно ввести фиксированный угол наклона, чтобы определить, как наклон сетки во время сбора может улучшить распределение изображений и выборку пространства Фурье. Мы выступаем за эту простую концепцию отбора проб и использование таких инструментов в качестве дополнения к распределению просмотров, чтобы зафиксировать различные аспекты влияния направлений проекции на крио-ЭМ реконструкции.

Брюггер К., Чжан К., Сухановский М.М., Ким Д.Д., Синклер А.Н., Люмкис, Д., Дьяконеску, AM Молекулярные детерминанты транслокации двухцепочечной ДНК за счет сопряжения транскрипции и репарации и фактора эволюционируемости Mfd. (2020) Природа связи. 11(1):3740. DOI: 10.1038/s41467-020-17457-1

+ развернуть аннотацию

Mfd связывает транскрипцию с эксцизионной репарацией нуклеотидов и действует на РНК-полимеразы, когда элонгация затруднена. В зависимости от серьезности препятствия это действие приводит либо к терминации транскрипции, либо к спасению элонгации, что зависит от АТФ-зависимой транслокации Mfd на ДНК. Из-за своей роли в устойчивости к антибиотикам Mfd также становится главной целью для разработки антиэволюционных лекарств. Здесь мы сообщаем о структуре ДНК-связанного Mfd, которая выявляет большие структурные изменения, индуцированные ДНК, которые связаны с активным центром через АТФазный мотив VI. Эти изменения устраняют аутоингибиторные контакты между N- и C-концами и демаскируют детерминанты узнавания UvrA. Мы также показываем, что транслокация зависит от треонина в мотиве Ic, широко консервативного в транслоказах, и специфичного для семейства гистидина вблизи мотива IVa, напоминающего «аргининовый зажим» РНК-хеликаз. Т.о., Mfd использует способ распознавания ДНК, который по своей сути является общим для транслоказ ss/ds, которые действуют на ДНК или РНК.

Смит, SJ, Чжао, XZ, Пассос, Д.О., Люмкис, Д., Берк, Т.Р., Хьюз, С.Х. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1, активные в отношении устойчивых к лекарственным средствам мутантов интегразы. (2020) Противомикробные препараты и химиотерапия. DOI: 10.1128/AAC.00611-20

+ развернуть аннотацию

В настоящее время рекомендуемой терапией первой линии для ВИЧ-1-инфицированных пациентов является ингибитор переноса цепи интегразы (IN) второго поколения (INSTI), либо долутегравир (DTG), либо биктегравир (BIC) в сочетании с двумя нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (НИОТ). . И DTG, и BIC сильно ингибируют большинство мутантов IN, устойчивых к INSTI, отобранных с помощью INSTI первого поколения. Не сообщалось, что BIC отбирает резистентность у пациентов, ранее не получавших лечения, а DTG отбирает небольшое количество устойчивых вирусов у пациентов, ранее не получавших лечения. Однако некоторые пациенты, у которых были обнаружены вирусы с заменами, выбранными с помощью ИИ ИИ первого поколения, плохо реагировали при переходе на терапию на основе DTG, и существуют мутанты, которые вызывают значительное снижение активности DTG и BIC в анализах. Было показано, что новый INSTI каботегравир (CAB), который находится на последней стадии клинических испытаний, отбирает новые устойчивые мутанты. Таким образом, важно разработать новые и улучшенные INSTI, которые эффективны против всех известных устойчивых мутантов. Это побудило нас протестировать наши лучшие ингибиторы параллельно с DTG, BIC и CAB в одноэтапном анализе инфекции на панели новых мутантов, устойчивых к CAB. Из протестированных нами INSTI BIC и наше соединение обладали наибольшей эффективностью. Оба превосходили DTG, о чем свидетельствуют данные, полученные с мутантом IN T66I/L74M/E138K/S147G/Q148R/S230N, который был отобран методом CAB с использованием лабораторного штамма, устойчивого к EVG. Эти результаты подтверждают доклиническую разработку и предоставляют информацию, которая может быть использована при разработке дополнительных ИИ, которые будут эффективны против широкого спектра устойчивых мутантов.

Пассос, Д.О., Ли, М., Юзвик, И.К., Чжао, XZ, Сантос-Мартинс, Д., Ян, Р., Смит, С.Дж., Чон, Ю., Форли, С., Хьюз, С.Х., Берк, Т.Р. , Крейги, Р., Люмкис, Д. Структурная основа связывания ингибитора переноса цепи с интасомами ВИЧ. (2020) Наука. DOI: 10.1126/science.aay8015.

+ развернуть аннотацию

Рабак-Гиббонс, Дж. Н., Попова, А. М., Грин, Э. М., Сервантес, К. Ф., Люмкис, Д., Уильямсон, младший SrmB спасает промежуточные звенья сборки рибосом. (2019) Журнал молекулярной биологии. DOI: 10.1016/j.jmb.2019.12.013

+ развернуть аннотацию

РНК-геликазы играют различную роль в биогенезе рибосом в зависимости от пути сборки рибосомы и стрессового состояния клетки. Однако неясно, как большинство РНК-хеликаз взаимодействуют с промежуточными продуктами сборки рибосом или с другими клеточными процессами, регулирующими сборку рибосом. SrmB представляет собой геликазу DEAD-box, которая действует на ранних этапах процесса сборки рибосомы, хотя о механизме ее действия известно очень мало. Здесь мы используем комбинированный подход количественной масс-спектрометрии/криоэлектронной микроскопии для детализации инвентаризации белков, состояния модификации рРНК и структур 40S рибосомных промежуточных соединений, которые образуются при делеции SrmB. Мы показываем, что сайт связывания SrmB не нарушен делецией SrmB, но центр пептидилтрансферазы, стебель uL7/12 и сайты контактов 30S демонстрируют серьезные дефекты сборки. Принимая во внимание существующие данные о функции SrmB и представленные здесь эксперименты, мы предлагаем несколько механизмов, с помощью которых SrmB может направлять сборку частиц из кинетических ловушек в компетентные субъединицы в процессе сборки 50S рибосомы.

Болдуин, PR, Люмкис, Д. Неравномерность распределения проекций снижает разрешение в крио-ЭМ. (2019) Прог. Биофиз. Мол. Биол. DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2019.09.002

+ развернуть аннотацию

Практически все эксперименты с крио-ЭМ с одной частицей в настоящее время страдают от прилипания образца к границе раздела воздух-вода, что приводит к неравномерному распределению в наборе проекций. В то время как общепризнанно, что однородное распределение проекций может привести к реконструкции с высоким разрешением, неравномерное (анизотропное) распределение может отрицательно сказаться на качестве карты, удлинить структурные особенности, а в некоторых случаях вообще запретить интерпретацию. Хотя некоторые последствия неравномерной выборки были описаны качественно, мы мало знаем о том, как выборка количественно влияет на разрешение в крио-ЭМ. Здесь мы показываем, как неоднородность в любой схеме распределения проекций ослабляет глобальную корреляцию оболочки Фурье (FSC) по отношению к количеству частиц и одному геометрическому параметру, который мы называем коэффициентом компенсации выборки (SCF). Обратная величина SCF определяется как среднее значение по оболочкам Фурье обратной величины выборки для каждой частицы и нормируется на единицу для однородных распределений. Таким образом, SCF колеблется от единицы до нуля, причем значения, близкие к последнему, указывают на большие области плохо отобранных или полностью отсутствующих данных в пространстве Фурье. Используя два синтетических теста, гемагглютинин гриппа и апоферритин человека, мы демонстрируем, как любая неоднородность выборки всегда ослабляет FSC по сравнению с однородным распределением. Мы выступаем за количественную оценку критерия SCF для аппроксимации влияния неоднородной выборки на разрешение в рамках экспериментальных реконструкций крио-ЭМ с одной частицей.

Полли, С., Люмкис, Д., Хортон, Северная Каролина Механизм индуцированной филаментацией аллостерической активации эндонуклеазы SgrAI. (2019) Структура. 27(10):1497-1507. DOI: 10.1016/j.str.2019.08.001

+ развернуть аннотацию

Формирование филаментов ферментами все больше признается важным явлением с потенциально уникальными регуляторными свойствами и биологическими ролями. SgrAI представляет собой аллостерически регулируемую эндонуклеазу рестрикции II типа, которая образует филаменты с повышенной активностью расщепления ДНК и измененной специфичностью последовательности. Здесь мы представляем криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ) структуру филамента SgrAI в его активированной конфигурации. Структурные данные проливают свет на механистическое происхождение сверхускоренной активности расщепления ДНК и предполагают, как непрямое считывание последовательности ДНК в нитевидном SgrAI может обеспечивать распознавание значительно большего количества нуклеотидных последовательностей, чем его низкоактивная форма, тем самым изменяя и частично ослабляя специфичность его последовательности ДНК. Вместе связывание ДНК субстрата, непрямое считывание и филаментация одновременно усиливают каталитическую активность SgrAI и модулируют предпочтение субстрата. Этот необычный ферментативный механизм, возможно, развился для выполнения специализированных функций врожденного иммунитета бактерий по быстрой защите от вторжения ДНК фага, не вызывая повреждения ДНК хозяина.

Хаак, Д.Б., Ян, X., Чжан, К., Хингей, Дж., Люмкис, Д., Бейкер Т.С., Тур Н. Крио-ЭМ структуры обратного сплайсинга интрона группы II в ДНК. (2019) Cell. 178(3):612-623.e12. DOI: 10.1016/j.cell.2019.06.035

+ развернуть аннотацию

Интроны группы II представляют собой класс ретроэлементов, которые вторгаются в ДНК с помощью механизма копирования и вставки, известного как ретротранспозиция. Их скоординированная активность происходит в комплексе, который включает белок матураза, который способствует сплайсингу по неизвестному механизму. Механизм обмена сайтами сплайсинга внутри активного центра РНК в процессе катализа также остается неясным. Мы определили две крио-ЭМ структуры с разрешением 3.6 Å интрона группы II, обратного сплайсинга в ДНК. Эти структуры показывают, что спираль VI домена сайта ветвления поворачивается на 90°, обеспечивая обмен субстрата во время интеграции ДНК. Матураза способствует катализу через временный РНК-белковый контакт с доменом VI, который позиционирует аденозин в месте разветвления для образования лариата во время прямого сплайсинга. Эти данные являются первыми прямыми доказательствами роли матуразы в катализе интронов группы II. Динамика домена VI близко параллельна движению спирали сайта разветвления сплайсосомы и предоставляет убедительные доказательства ретроэлементного происхождения сплайсосомы.

Конеру, П.С., Фрэнсис, А.С., Денг, Н., Ребенсбург, С.В., Хойт, А.С., Линденбергер, Дж., Аду-Ампратвум, Д., Ларю, Р.С., Вемпе, М.Ф., Энгельман, А.Н., Люмкис, Д., Фукс Дж.Р., Леви Р.М., Меликян Г.Б., Кварацхелия М. Тетрамеры интегразы ВИЧ-1 являются противовирусной мишенью ингибиторов аллостерической интегразы на основе пиридина. (2019) Элиф. 8. DOI: 10.7554/eLife.46344

+ развернуть аннотацию

Аллостерические ингибиторы интегразы ВИЧ-1 (IN) (ALLINI) представляют собой многообещающий новый класс антиретровирусных агентов, которые нарушают правильное созревание вируса, индуцируя гипермультимеризацию IN. Здесь мы показываем, что ALLINI KF116 на основе пиридина свинца проявляет поразительную селективность в отношении тетрамеров IN по сравнению с олигомерами белков более низкого порядка. Структурные особенности IN, которые необходимы для его функциональной тетрамеризации и репликации HIV-1, также критически важны для KF116-опосредованной мультимеризации IN более высокого порядка. Визуализация живых клеток отдельных вирусных частиц показала, что обработка KF116 во время продукции вириона ставит под угрозу тесную ассоциацию IN с ядрами капсида во время последующего инфицирования клеток-мишеней. Мы синтезировали высокоактивный энантиомер (-)-KF116, который показал EC7 ~1 нМ против ВИЧ-10 дикого типа и ~XNUMX-кратно более высокую субнМ активность против клинически значимого мутантного вируса, устойчивого к долутегравиру, что предполагает потенциальные клинические преимущества для дополнение терапии долутегравиром ALLINI на основе пиридина.

Люмкис, Д. Проблемы и возможности крио-ЭМ анализа отдельных частиц. (2019) Журнал биологической химии. DOI: 10.1074/jbc.REV118.005602.

+ развернуть аннотацию

Чжан К., Кантара В., Чон Ю., Мюзиер-Форсайт К., Григорьев Н., Люмкис, Д. Анализ дискретной локальной изменчивости и структурной ковариации макромолекулярных ансамблей с использованием крио-ЭМ и целенаправленной классификации. (2018) Ультрамикроскопия. DOI: 10.1016/j.ultramic.2018.11.016

+ развернуть аннотацию

Электронная криомикроскопия отдельных частиц и компьютерная классификация изображений могут использоваться для анализа структурной изменчивости макромолекул и их сборок. В некоторых случаях частица может содержать разные области, каждая из которых имеет ряд различных конформаций. Мы разработали стратегии, реализованные в пакетах обработки изображений Frealign и cisTEM, для фокусировки-классификации на определенных областях частицы и обнаружения потенциальной ковариации. Стратегии основаны на маскировании интересующей области с использованием либо 2-мерной маски, применяемой к эталонным проекциям и изображениям частиц, либо 3-мерной маски, применяемой к 3-мерному объему. Мы показываем, что сфокусированные подходы к классификации могут быть использованы для изучения структурной ковариации, концепции, которая, вероятно, приобретет все большее значение по мере увеличения размера наборов данных, позволяя различать большее количество структурных состояний и меньшие различия между состояниями. Наконец, мы применяем подходы к экспериментальному набору данных, содержащему РНК элемента ответа на трансактивацию ВИЧ-1 (TAR), слитую с большой бактериальной рибосомной субъединицей, для деконволюции структурной подвижности в пределах локализованных интересующих областей, и к набору данных, содержащему промежуточные соединения сборки большой субъединицы. для измерения структурной ковариации.

Тан, Ю. З., Айер, С., Митч, М., Халл, Дж. А., Маккенна, Р., Григер, Дж., Самульски, Р. Дж., Бейкер, Т. С., Агбандже-Маккенна, М., Люмкис, Д. Структура варианта капсида AAV2 с поправкой на кривизну Sub-2 Å Эвальда. (2018) Природа связи. 9(1):3628. DOI: 10.1038/s41467-018-06076-6

+ развернуть аннотацию

Чжан, К., Конерманн, С., Бридо, Н.Дж., Лотфи, П., Ву, X., Новик, С.Дж., Струценберг, Т., Гриффин, П.Р., Сюй, П.Д., Люмкис, Д. Структурная основа РНК-управляемой рибонуклеазной активности CRISPR-Cas13d. [Опубликовано] (2018) Cell. 175(1):212-223.e17. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.001

+ развернуть аннотацию

Эндонуклеазы CRISPR-Cas, направленные против чужеродных нуклеиновых кислот, опосредуют прокариотический адаптивный иммунитет и были адаптированы для широкого применения в генной инженерии. Системы CRISPR типа VI-D содержат наименьшее известное семейство одиночных эффекторных ферментов Cas, а их сигнатурная рибонуклеаза Cas13d использует направляющие РНК для расщепления соответствующих РНК-мишеней. Чтобы понять молекулярную основу функции Cas13d и объяснить ее компактную молекулярную архитектуру, мы разрешили криоэлектронную микроскопию структур бинарного комплекса Cas13d-направляющая РНК и тройного комплекса Cas13d-направляющая-РНК-мишень до разрешения 3.4 и 3.3 Å соответственно. Кроме того, реконструкция 6.5 Å апо Cas13d в сочетании с водородно-дейтериевым обменом выявила конформационную динамику, которая имеет значение для сканирования РНК. Эти структуры вместе с биохимическими и клеточными характеристиками дают представление о его РНК-управляемом механизме нацеливания на РНК и намечают план для рационального проектирования улучшенных технологий инженерии транскриптома.

Тан, Ю. З., Болдуин, П. Р., Дэвис, Дж. Х., Уильямсон, младший, Поттер, К. С., Каррагер, Б., Люмкис, Д. Решение проблемы предпочтительной ориентации образца в крио-ЭМ с одной частицей за счет наклона. (2017) Природные методы. 14(8):793-796. DOI: 10.1038/nmeth.4347

+ развернуть аннотацию

Озоровский Г., Паллесен Дж., де Валь Н., Люмкис, Д., Коттрелл, К.А., Торрес, Дж.Л., Коппс, Дж., Стэнфилд, Р.Л., Купо, А., Пугач, П., Мур, Дж.П., Уилсон, И.А., Уорд, А.Б. Открытые и закрытые структуры обнаруживают аллостерию и гибкость спайка оболочки ВИЧ-1. (2017) Природа. 547 (7663): 360-363. DOI: 10.1038/nature23010

+ развернуть аннотацию

Для многих оболочечных вирусов связывание с рецептором(ами) на клетке-хозяине действует как первый шаг в серии событий, кульминацией которых является слияние с мембраной клетки-хозяина и передача генетического материала для репликации. Тример оболочечного гликопротеина (Env) на поверхности ВИЧ отвечает за связывание и слияние рецепторов. Хотя Env может допускать высокую степень мутации в пяти вариабельных областях (V1-V5), а также в сайтах N-связанного гликозилирования, которые составляют примерно половину массы Env, функциональные сайты для распознавания рецептора CD4 и корецептора CXCR4/ CCR5 консервативны и необходимы для приспособленности вирусов. Растворимые тримеры SOSIP Env представляют собой структурные и антигенные имитаторы нативного Env до слияния, представленного на поверхности, и являются мишенями для широкого спектра нейтрализующих антител. Таким образом, они являются привлекательными иммуногенами для разработки вакцин. Здесь мы представляем структуры криоэлектронной микроскопии высокого разрешения тримеров B41 SOSIP Env подтипа B в комплексе с CD4 и антителом 17b или с антителом b12 с разрешением 3.7 Å и 3.6 Å соответственно. Мы сравниваем их с реконструкциями криоэлектронной микроскопии тримеров B41 SOSIP Env без лиганда или в комплексе либо с CD4, либо с антителом PGV4 к сайту связывания CD04 с разрешением 5.6 Å, 5.2 Å и 7.4 Å соответственно. Следовательно, мы представляем наиболее полное описание, насколько нам известно, CD4-17b-индуцированного промежуточного продукта и обеспечиваем молекулярную основу индуцированного связыванием рецептора конформационного изменения, необходимого для проникновения ВИЧ-1 в клетки-хозяева. Как CD4, так и b12 индуцируют большие, ранее не охарактеризованные конформационные перестройки в субъединицах gp41, и слитый пептид оказывается скрытым во вновь образованном кармане. Эти структуры предоставляют ключевую информацию о биологической функции машины слияния вирусов типа I из ВИЧ-1, а также новые шаблоны для разработки ингибиторов.

Пассос Д.О., Ли М., Ян Р., Ребенсбург С.В., Гирландо Р., Чон Ю., Шкриабай Н., Кварацхелия М., Крейги Р., Люмкис, Д. Крио-ЭМ структуры и атомная модель комплекса переноса цепи ВИЧ-1 в интасому. (2017) Наука. 355 (6320): 89-92. DOI: 10.1126/science.aah5163

+ развернуть аннотацию

Дэвис, Дж. Х., Тан, Ю. З., Каррагер, Б., Поттер, К. С., Люмкис, Д., Уильямсон, младший Модульная сборка бактериальной большой рибосомной субъединицы. (2016) Cell. 167(6):1610-1622.e15. DOI: 10.1016/j.cell.2016.11.020

+ развернуть аннотацию

Рибосома представляет собой сложную макромолекулярную машину и служит идеальной системой для понимания сборки биологических макромолекул. Непосредственное наблюдение за сборкой рибосом in vivo затруднено, так как было выделено и тщательно охарактеризовано несколько промежуточных продуктов. Здесь мы используем генетическую систему, чтобы лишать клетки необходимого рибосомного белка, что приводит к накоплению промежуточных продуктов сборки, способных к созреванию. Количественная масс-спектрометрия и криоэлектронная микроскопия отдельных частиц выявили 13 различных промежуточных соединений, каждое из которых было разрешено с разрешением ~ 4-5 Å и могло быть помещено в путь сборки. Мы обнаружили, что биогенез рибосом представляет собой параллельный процесс, что блоки структурированных рРНК и белков собираются совместно, и что весь процесс динамичен и может быть «перенаправлен» по различным путям по мере необходимости. Эта работа раскрывает сложную картину сборки рибосом in vivo и предоставляет необходимые инструменты для характеристики дополнительных путей сборки рибосом и других макромолекулярных машин.

Полли С., Пассос Д.О., Хуанг Д.Б., Мулеро М.С., Мазумдер А., Бисвас Т., Верма И.М., Люмкис, Д., Гош, Г. Структурные основы активации IKK1/α. (2016) Сотовые отчеты 17(8):1907-1914. DOI: 10.1016/j.celrep.2016.10.067

+ развернуть аннотацию

Различные сигнальные пути активируют семейство факторов транскрипции NF-κB. Канонический путь передачи сигналов NF-κB опосредован киназой IκB 2/β (IKK2/β), в то время как неканонический путь зависит от IKK1/α. Структурные и биохимические основы для передачи различных сигналов этими во всем остальном очень похожими IKK неясны. Мы сообщаем о криоэлектронной микроскопии отдельных частиц (крио-ЭМ) и рентгеновских кристаллических структурах IKK1 человека в димерной (~ 150 кДа) и гексамерной (~ 450 кДа) формах. Гексамер, который является репрезентативной формой в кристалле, но содержит только около 2% частиц в растворе по данным крио-ЭМ, представляет собой тример димеров IKK1. В то время как гексамеры IKK1 не обнаруживаются в клетках, поверхность, которая поддерживает образование гексамеров, является критической для IKK1-зависимого клеточного процессинга p100 до p52, отличительной черты неканонической передачи сигналов NF-κB. Сравнение этой поверхности с таковой в IKK2 указывает на значительную дивергенцию и указывает на фундаментальную роль этой поверхности в передаче сигналов этими киназами через различные пути.

Балландрас-Колас А., Браун М., Кук Н.Дж., Дьюдни Т.Г., Демелер Б., Черепанов П., Люмкис, Д., Энгельман А.Н. Cryo-EM раскрывает новую структуру октамерной интегразы для функции бетаретровирусной интасомы. (2016) Природа. 530 (7590): 358-61. DOI: 10.1038/nature16955

+ развернуть аннотацию

Ретровирусная интеграза катализирует интеграцию вирусной ДНК в ДНК-мишень хозяина, что является важным этапом в жизненном цикле всех ретровирусов. Предыдущая структурная характеристика комплексов интеграза-вирусная ДНК или интасом из прототипа пенистого вируса спумавируса выявила функциональный тетрамер интегразы, и обычно считается, что интасомы, полученные из других родов ретровирусов, используют тетрамерную интегразу. Однако структурно не охарактеризованы интасомы орторетровирусов, к которым относятся все известные патогенные виды. Здесь, используя криоэлектронную микроскопию с одной частицей и рентгеновскую кристаллографию, мы определяем неожиданную архитектуру октамерной интегразы для интасомы бетаретровируса вируса опухоли молочной железы мыши. Структура состоит из двух димеров ядра интегразы, которые взаимодействуют с концами вирусной ДНК и структурно имитируют тетрамер интегразы прототипа пенистого вируса, и двух фланкирующих димеров интегразы, которые взаимодействуют со структурой ядра через свои карбоксиконцевые домены интегразы. Вопреки убеждению, что компонентов тетрамерной интегразы достаточно для катализа интеграции, фланкирующие димеры интегразы были необходимы для активности интегразы вируса опухоли молочной железы мыши. Октамер интегразы решает загадку для бетаретровирусов, а также для альфа-ретровирусов, предоставляя критические карбоксиконцевые домены ядру интасомы, которые не могут быть обеспечены в цис-положении из-за эволюционно ограничительных каталитических линкерных областей кор-домен-карбокси-концевой домен. Октамерная архитектура интасомы вируса опухоли молочной железы мыши обеспечивает новое понимание структурной основы интеграции ретровирусной ДНК.

Пассос, Д.О., Люмкис, Д. КриоЭМ анализ отдельных частиц с разрешением, близким к атомному, из нескольких тысяч асимметричных субъединиц. (2015) Журнал структурной биологии. 192(2):235-44. DOI: 10.1016/j.jsb.2015.10.002

+ развернуть аннотацию

Крио-ЭМ-реконструкция одной частицы большой рибосомной субъединицы из Saccharomyces cerevisiae была получена из набора данных, состоящего примерно из 75,000 60 частиц. Золотой стандарт и ограниченный по частоте подход к уточнению отдельных частиц использовались независимо друг от друга для определения параметров ориентации для окончательной реконструкции. Оба подхода показали аналогичные кривые разрешения и номинальные значения разрешения для набора данных 2.9S, оцененные в 200 Å. Величина переобучения, присутствующая во время уточнения с ограничением по частоте, была количественно проанализирована с использованием теста фазовой рандомизации с высоким разрешением, и результаты не показали явного переобучения. Количество асимметричных субъединиц, необходимых для достижения определенных разрешений, впоследствии было проанализировано путем уточнения подмножеств данных ab initio. С нашими стратегиями сбора и обработки данных субнанометровое разрешение было получено с ~ 5.6 асимметричными субъединицами (или, что эквивалентно рибосомной субъединице, частицами). Разрешения 4.5 Å, 3.8 Å и 1000 Å были достигнуты с ∼1600, ∼5000 и ∼6 асимметричных субъединиц соответственно. При таком разрешении можно было бы ожидать обнаружения шага альфа-спирали, разделения бета-цепей и разделения атомов Cα соответственно. Используя эту карту вместе со стратегиями построения модели ab initio и уточнения модели, мы построили область рибосомного белка eLXNUMX, которая отсутствовала в предыдущих моделях дрожжевой рибосомы. Обсуждается актуальность более рутинного определения структуры с высоким разрешением.

Ли, Дж. Х., де Валь, Н., Люмкис, Д., Уорд, AB Построение модели и уточнение природного гликозилированного белка Env ВИЧ-1 с помощью криоэлектронной микроскопии высокого разрешения. (2015) Структура. 23(10):1943-51. DOI: 10.1016/j.str.2015.07.020

+ развернуть аннотацию

Секреторные и мембранные белки клеток млекопитающих подвергаются посттрансляционным модификациям, включая N-связанное гликозилирование, что может привести к большому количеству возможных гликоформ. Эта неоднородность образца может быть проблематичной для структурных исследований, особенно для рентгеновской кристаллографии. Таким образом, кристаллические структуры сильно гликозилированных белков, таких как вирусный шиповидный белок Env ВИЧ-1, были определены путем удаления большинства гликанов. Этот этап чаще всего выполняется с использованием эндогликозидазы H (EndoH) и требует, чтобы все экспрессированные гликаны находились в форме с высоким содержанием маннозы, которая часто не является нативной гликоформой. Благодаря значительно улучшенным технологиям криоэлектронной микроскопии отдельных частиц мы демонстрируем, что теперь можно совершенствовать и создавать нативно гликозилированные структуры Env ВИЧ-1 в растворе с разрешением 4.36 Å. При таком разрешении теперь мы можем проанализировать полный эпитоп широко нейтрализующего антитела (bnAb), PGT128, в контексте тримера, экспрессируемого нативными гликанами.

Люмкис, Д., Оливейра душ Пассос, Д., Тахара, Э.Б., Уэбб, К., Беннетт, Э.Дж., Винтербо, С., Поттер, К.С., Каррагер, Б., Жоазейру, Калифорния Структурная основа для наблюдения за трансляцией с помощью комплекса контроля качества белка, связанного с большой рибосомной субъединицей. (2014) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 111(45):15981-6. DOI: 10.1073/pnas.1413882111

+ развернуть аннотацию

Все организмы развили механизмы управления остановкой рибосом при трансляции аберрантной мРНК. У эукариот комплекс контроля качества, связанный с большой рибосомной субъединицей (RQC), состоящий из убиквитинлигазы листерин/Ltn1 E3 и кофакторов, опосредует убиквитилирование и экстракцию зарождающихся полипептидных цепей, застрявших на рибосомах, для протеасомной деградации. Как RQC распознает остановившиеся рибосомы и выполняет свои функции, неясно. С помощью одночастичной криоэлектронной микроскопии мы определили структуру комплекса RQC, связанного с застопорившимися 60S рибосомными субъединицами. Структура устанавливает, как Ltn1 связывается с большой рибосомной субъединицей и правильно позиционирует свой E3-каталитический RING-домен, чтобы обеспечить убиквитилирование зарождающейся цепи. Структура также показывает, что отличительной чертой остановившихся 60S-частиц является открытая, зарождающаяся конъюгированная цепь тРНК, и что субъединица Tae2 RQC, которая облегчает связывание Ltn1, отвечает за избирательное распознавание остановленных 60S-субъединиц. Компоненты RQC участвуют во взаимодействиях на большом участке поверхности 60S субъединицы, соединяя тРНК в пептидилтрансферазном центре с дистально расположенным выходом туннеля формирующейся цепи. Эта работа дает представление о механизме, связывающем трансляцию и деградацию белка, который нацелен на дефектные белки сразу после синтеза, игнорируя зарождающиеся цепи в нормально транслирующихся рибосомах.

Сашитал, Д.Г., Гриман, Калифорния, Люмкис, Д., Поттер, К.С., Каррагер, Б., Уильямсон, младший Комбинированный количественный анализ масс-спектрометрии и электронной микроскопии сборки рибосомных 30S субъединиц в E. coli. (2014) Элиф. 3. DOI: 10.7554/eLife.04491

+ развернуть аннотацию

Люмкис, Д., Жюльен, Дж.П., де Валь, Н., Купо, А., Поттер, К.С., Классе, П.Дж., Бертон, Д.Р., Сандерс, Р.В., Мур, Дж.П., Каррагер, Б., Уилсон, И.А., Уорд, А.Б. Крио-ЭМ структура полностью гликозилированного растворимого расщепленного тримера оболочки ВИЧ-1. (2013) Наука. 342 (6165): 1484-90. DOI: 10.1126/наука.1245627

+ развернуть аннотацию

Жюльен, Дж.П., Купо, А., Сок, Д., Стэнфилд, Р.Л., Люмкис, Д., Деллер, М.С., Класс, П.Дж., Бертон, Д.Р., Сандерс, Р.В., Мур, Д.П., Уорд, А.Б., Уилсон, И.А. Кристаллическая структура растворимого расщепленного тримера оболочки ВИЧ-1. (2013) Наука. 342 (6165): 1477-83. DOI: 10.1126/наука.1245625

+ развернуть аннотацию

Люмкис, Д., Винтербо С., Поттер К.С., Каррагер Б. Optimod — автоматизированный подход к построению и оптимизации исходных моделей для электронной микроскопии отдельных частиц. (2013) Журнал структурной биологии. 184(3):417-26. DOI: 10.1016/j.jsb.2013.10.009

+ развернуть аннотацию

Одночастичная криоэлектронная микроскопия в настоящее время хорошо зарекомендовала себя как метод структурной характеристики больших макромолекул и макромолекулярных комплексов. Необработанные данные очень зашумлены и состоят из двухмерных проекций, из которых необходимо реконструировать трехмерный биологический объект. Трехмерный объект зависит от знания правильных угловых ориентаций, назначенных двумерным проекционным изображениям. Было разработано множество алгоритмов для определения относительной угловой ориентации между 3D-изображениями, но переход от 3D к 2D остается сложным и может привести к ошибочным и противоречивым результатам. Здесь мы описываем общую автоматизированную процедуру, называемую OptiMod, для реконструкции и оптимизации 2D-моделей с использованием методологий общих линий. OptiMod аппроксимирует углы ориентации и реконструирует независимые карты на основе средних значений класса 2D. Затем он повторяет процедуру, рассматривая каждую карту как необработанное решение, которое необходимо сравнить с другими возможными результатами. Мы включили процедуры 3D-выравнивания, кластеризации и уточнения для оптимизации каждой карты, а также стандартные метрики оценки, чтобы облегчить выбор оптимальной модели. Мы также показываем, что данные пары наклона под малым углом могут быть включены в качестве одной из оценочных метрик, чтобы улучшить выбор оптимальной начальной модели, а также обеспечить проверку достоверности. Общий подход демонстрируется с использованием двух наборов экспериментальных крио-ЭМ данных: рибосома 3S, которая представляет собой относительно простой случай реконструкции ab initio, и комплекс Tf-TfR, который представляет собой сложный случай, поскольку ранее было показано, что он обеспечивает множественные одинаково правдоподобные решения исходной модельной задачи.

Люмкис, Д., Тэлли, Х., Стюарт, А., Шах, С., Парк, К.К., Тама, Ф., Поттер, К.С., Каррагер, Б., Хортон, Северная Каролина Аллостерическая регуляция расщепления ДНК и специфичности последовательности посредством непрерывной олигомеризации. (2013) Структура. 21(10):1848-58. DOI: 10.1016/j.str.2013.08.012

+ развернуть аннотацию

SgrAI представляет собой специфичную к последовательности ДНК-эндонуклеазу, которая функционирует посредством необычного ферментативного механизма, который аллостерически активируется в 200-500 раз эффекторной ДНК с сопутствующим расширением специфичности ее ДНК-последовательности. Используя просвечивающую электронную микроскопию отдельных частиц для реконструкции различных популяций олигомеров SgrAI, мы показали, что в присутствии аллостерической активирующей ДНК фермент образует регулярные повторяющиеся спиральные структуры, характеризующиеся добавлением ДНК-связывающих димерных субъединиц SgrAI в последовательном порядке. на манер. Мы также представляем структуру олигомерного SgrAI с разрешением 8.6 Å, демонстрируя конформационное состояние SgrAI в его активированной форме. Активированный и олигомерный SgrAI демонстрирует ключевые белок-белковые взаимодействия вблизи оси спирали между ее N-концами, а также аллостерические взаимодействия белок-ДНК, которые необходимы для ферментативной активации. Гибридный подход раскрывает необычный механизм активации фермента, который объясняет олигомеризацию и аллостерическое поведение SgrAI.

Люмкис, Д., Брило А.Ф., Теобальд Д.Л., Григорьев Н. Классификация крио-ЭМ изображений на основе правдоподобия с использованием FREALIGN. (2013) Журнал структурной биологии. 183(3):377-388. DOI: 10.1016/j.jsb.2013.07.005

+ развернуть аннотацию

Йошиока, К., Люмкис, Д., Каррагер Б., Поттер К.С. Maskiton: интерактивная веб-классификация изображений электронной микроскопии отдельных частиц. (2013) Журнал структурной биологии. 182(2):155-63. DOI: 10.1016/j.jsb.2013.02.007

+ развернуть аннотацию

Электронная микроскопия (ЭМ) является важным инструментом для определения состава, расположения и структуры биологических макромолекул. При изучении структурно-неоднородных образцов с помощью ЭМ классификация является важным шагом на пути к достижению более высокого разрешения и идентификации биологически значимых конформаций. Мы разработали интерактивный веб-инструмент под названием Maskiton для создания пользовательских масок и выполнения 2D-классификаций на выровненных одночастичных ЭМ-изображениях. Интерфейс Maskiton значительно упрощает и ускоряет изучение значения неоднородности в наборах данных по отдельным частицам. Функции Maskiton включают в себя: возобновляемую загрузку для облегчения передачи больших наборов данных на сервер, создание пользовательской маски в браузере, постоянное обновление прогресса и интерактивный просмотр результатов классификации. Чтобы продемонстрировать ценность этого инструмента, мы приводим примеры его использования на нескольких наборах экспериментальных данных и включаем анализ независимой подвижности концов в убиквитинлигазе Ltn1 E3, сборку 30S рибосомных субъединиц in vitro и снижение сложности классификации в иммуноглобулине М. Эта работа также служит доказательством концепции разработки будущих кросс-платформенных интерактивных пользовательских интерфейсов для обработки данных электронной микроскопии.

Люмкис, Д., Доамекпор, СК, Бенгтсон, М.Х., Ли, Дж.В., Торо, ТБ, Петроски, доктор медицины, Лима, CD, Поттер, К.С., Каррагер, Б., Жоазейро, Калифорния Одночастичная ЭМ обнаруживает обширную конформационную изменчивость лигазы Ltn1 E3. (2013) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 110(5):1702-7. DOI: 10.1073/pnas.1210041110

+ развернуть аннотацию

Ltn1 представляет собой убиквитинлигазу E180 с молекулярной массой 3 кДа, которая связывается с рибосомами и маркирует определенные аберрантные, трансляционно арестованные формирующиеся полипептидные цепи для протеасомной деградации. В дополнение к своему эволюционно консервативному большому размеру, Ltn1 характеризуется наличием консервативного N-конца, повторов HEAT/ARM, которые, по прогнозам, составляют большую часть белка, и С-концевого каталитического домена RING, хотя точная структура белка неизвестна. . Мы использовали многочисленные стратегии ЭМ с одной частицей, чтобы охарактеризовать структуру Ltn1 на основе отрицательных данных о окрашивании и стекловидном льду. Двумерные классификации и последующие 3D реконструкции карт электронной плотности показывают, что Ltn1 имеет удлиненную форму и представляет собой континуум конформационных состояний вокруг двух гибких шарнирных областей, тогда как его общая архитектура напоминает многосубъединичные комплексы cullin-RING ubiquitin ligase. Мы предлагаем модель функции Ltn1, основанную на его конформационной изменчивости и гибкости, которая описывает, как эти особенности могут играть роль в котрансляционном контроле качества белков.

Кэмпбелл М.Г., Ченг А., Брилот А.Ф., Меллер А., Люмкис, Д., Визлер Д., Пэн Дж., Харрисон С.К., Поттер К.С., Каррагер Б., Григорьев Н. Фильмы о частицах, покрытых льдом, улучшают разрешение в электронной криомикроскопии. (2012) Структура. 20(11):1823-8. DOI: 10.1016/j.str.2012.08.026

+ развернуть аннотацию

Милаццо А.С., Ченг А., Меллер А., Люмкис, Д., Яковетти, Э., Полукас, Дж., Эллисман, М.Х., Сюонг, Н.Х., Каррагер, Б., Поттер, К.С. Первоначальная оценка детектора устройства прямого обнаружения для криоэлектронной микроскопии отдельных частиц. (2011) Журнал структурной биологии. 176(3):404-8. DOI: 10.1016/j.jsb.2011.09.002

+ развернуть аннотацию

Восс, НР, Люмкис, Д., Ченг, А., Лау, П.В., Малдер, А., Ландер, Г.К., Бриньоль, Э.Дж., Фелльманн, Д., Ирвинг, К., Яковетти, Э.Л., Леунг, А., Пулокас, Дж., Киспе, Д.Д. , Винклер Х., Йошиока К., Каррагер Б., Поттер К.С. Набор инструментов для трехмерных реконструкций ab initio в одночастичной электронной микроскопии. (2010) Журнал структурной биологии. 169(3):389-98. DOI: 10.1016/j.jsb.2009.12.005

+ развернуть аннотацию

Определение структуры нового макромолекулярного комплекса с помощью электронной микроскопии отдельных частиц зависит от решения проблемы создания надежной трехмерной реконструкции с использованием только двумерных изображений. Существует множество стратегий, решающих эту проблему, но не все из них доступны и просты в использовании. Мы разработали «набор инструментов» методов реконструкции ab initio, которые предоставляют несколько вариантов расчета трехмерных объемов в легко управляемом и строго контролируемом рабочем процессе, который придерживается стандартных соглашений и форматов. Этот набор инструментов предназначен для оптимизации процесса реконструкции за счет устранения необходимости ведения бухгалтерского учета и облегчения прозрачной передачи данных между различными программными пакетами. В настоящее время он включает процедуры для расчета реконструкций ab initio с помощью случайной или ортогональной геометрии наклона, томограмм и общих линий, все из которых были протестированы с использованием рибосомной субъединицы 3S. Наша цель состоит в том, чтобы доступность нескольких независимых алгоритмов реконструкции через этот набор инструментов упростила создание моделей и предоставила средства для оценки достоверности и надежности окончательной реконструированной карты.

Люмкис, Д., Меллер, А., Ченг, А., Герольд, А., Хоу, Э., Ирвинг, К., Яковетти, Э.Л., Лау, П.В., Малдер, А.М., Пулокас, Дж., Киспе, Д.Д., Восс, Н.Р. , Поттер, К.С., Каррагер, Б. Автоматизация в одночастичной электронной микроскопии, соединяющая кусочки. (2010) Мет. фермент. 483:291-338. DOI: 10.1016/S0076-6879(10)83015-0

+ развернуть аннотацию

На протяжении всей истории одночастичной электронной микроскопии (ЭМ) автоматизированные технологии получали разную степень внимания и развития, обычно в зависимости от современных требований в этой области. В настоящее время мы сталкиваемся со все более сложными устройствами для подготовки образцов, огромным увеличением объема собираемых наборов данных, всесторонними алгоритмами обработки изображений, сложными инструментами для оценки качества и притоком заинтересованных ученых из других областей, которым может не хватать навыков опытные микроскописты. Эта ситуация делает автоматизированные методы очень востребованными. В этой главе мы даем общее определение и обсуждаем некоторые из наиболее важных достижений в автоматизированных подходах к подготовке образцов, обработке сетки, роботизированному скринингу, калибровке микроскопов, сбору данных, обработке изображений и вычислительной инфраструктуре. В каждом разделе описывается общая проблема, а затем приводятся примеры того, как эта проблема была решена с помощью автоматизации, выделяются доступные пакеты обработки и иногда описывается конкретный подход в Национальном ресурсе автоматизированной молекулярной микроскопии (NRAMM). Мы противопоставляем более знакомые ручные процедуры автоматизированным подходам, подчеркивая прорывы, а также текущие ограничения. Наконец, мы размышляем о будущих направлениях и улучшениях в автоматизированных технологиях. Наша общая цель — представить автоматизацию как нечто большее, чем просто инструмент для экономии времени. Скорее, мы стремимся проиллюстрировать, что автоматизация — это всеобъемлющая и универсальная стратегия, которая может предоставлять биологическую информацию в беспрецедентных масштабах, выходящих за рамки возможностей, доступных при использовании классических ручных подходов.

Ландер, Г.К., Стагг, С.М., Восс, Н.Р., Ченг, А., Фелльманн, Д., Пулокас, Дж., Йошиока, К., Ирвинг, К., Малдер, А., Лау, П.В., Люмкис, Д., Поттер, К.С., Каррагер, Б. Appion: интегрированный конвейер, управляемый базой данных, для упрощения обработки ЭМ-изображений. (2009) Журнал структурной биологии. 166(1):95-102. DOI: 10.1016/j.jsb.2009.01.002

+ развернуть аннотацию

Использование криоЭМ и трехмерной реконструкции изображений становится все более распространенным. Наше видение этого метода состоит в том, чтобы предоставить пользователям простой способ перехода от необработанных данных к надежной 3D-реконструкции через конвейер, который одновременно облегчает управление этапами обработки и делает результаты на каждом этапе более прозрачными. Тесно интегрированный с реляционной базой данных SQL, Appion представляет собой модульный и прозрачный конвейер, который расширяет существующие программные приложения и процедуры. Пользователь управляет программными модулями и контролирует их через веб-формы, и все результаты также доступны с помощью веб-средств просмотра, напрямую связанных с базовой базой данных, что позволяет даже неопытным пользователям быстро определить качество своих результатов. Appion API был разработан с учетом того, что приложения должны быть совместимы с широким спектром образцов, а библиотеки и подпрограммы должны быть модульными и расширяемыми. Здесь представлено описание дизайна и архитектуры рабочего прототипа конвейера Appion и некоторые результаты его использования.

Дмитрий Люмкис, к.б.н.

Институт биологических исследований Солка - Публикации

все публикации

Поддержите исследования Солка

Образование

Награды и награды

Профиль

Особенности

Вебсайт

Контакты