Publicações - Salk Institute for Biological Studies

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2025

Kumar, AJ, Epler, K., Wang, J., Shen, A., Samandari, N., Rolfsen, ML, Barnes, LA, Shadel, GS, Moyzis, AG, Sainz, AG, Ulubabyan, K., Li, K., Jepsen, K., Li, X., Fuster, MM, Spragg, RG, Sasik, R., Vallon, V., Goodluck, H., Ix, JH, Singh, P., Hepokoski, ML O DNA mitocondrial renal contribui para a liberação sistêmica de IL-6 na lesão renal aguda associada à sepse. (2025) Visão JCI. 10(23). DOI: 10.1172/jci.insight.177004

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Esparza-Moltó, PB, Goswami, AV, Bozkurt, S., Münch, C., Newman, LE, Moyzis, AG, Rojas, GR, Guan, D., Jones, JR, Gage, FH, Shadel, GS Localização dependente de ROS de enzimas glicolíticas nas mitocôndrias. (2025) Redox Biol. 86:103812. DOI: 10.1016/j.redox.2025.103812

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Espécies reativas de oxigênio mitocondriais (mtROS) regulam as vias de sinalização celular, mas também causam estresse oxidativo quando desreguladas durante o envelhecimento e em condições patológicas, como doenças neurodegenerativas. A redistribuição dinâmica de proteínas entre compartimentos celulares é um mecanismo comum para controlar sua estabilidade e atividades biológicas. Ao direcionar a biotina ligase BirA∗ para a membrana mitocondrial externa em células HEK293, identificamos proteínas cuja marcação aumentou ou diminuiu em resposta ao tratamento com menadiona, consistente com uma mudança dinâmica em sua localização mitocondrial em resposta ao aumento da produção de mtROS. Essas proteínas representam potenciais candidatas para estudos futuros de sinalização de estresse oxidativo mitocondrial. Um subconjunto de enzimas glicolíticas foi encontrado nesta triagem e confirmado, por fracionamento mitocondrial e imagem, por aumentar a localização nas mitocôndrias em resposta à menadiona, apesar de não haver alteração em sua abundância geral. Estudos de fracionamento submitocondrial são consistentes com a importação de um conjunto dessas enzimas para o espaço intermembranar mitocondrial. A localização de enzimas glicolíticas nas mitocôndrias também foi aumentada em células cultivadas sob hipóxia ou que expressam uma d-aminoácido oxidase direcionada às mitocôndrias (condições que induzem aumento na produção de mtROS) e inibida basalmente em condições normais de crescimento pelo antioxidante mitocondrial MnTBAP. Finalmente, fibroblastos primários da doença de Alzheimer também apresentaram enzimas glicolíticas associadas às mitocôndrias que foram reduzidas por antioxidantes, consistente com o aumento de mtROS, alterando sua distribuição relativa entre o citoplasma e as mitocôndrias. Especulamos que o aumento da localização mitocondrial de enzimas glicolíticas seja uma resposta adaptativa às mtROS que altera o fluxo de glicose em direção à via antioxidante das pentoses fosfato, cria pools regulatórios distintos de metabólitos mitocondriais ou novos circuitos metabólicos e/ou fornece citoproteção ou outras respostas adaptativas por meio de funções de reserva não relacionadas à sua atividade enzimática.

Sainz, AG, Rojas, GR, Moyzis, AG, Donnelly, MP, Mangalhara, KC, Johnson, MA, Esparza-Moltó, PB, Grae, KJ, Shaw, RJ, Shadel, GS FAM43A coordena a replicação do mtDNA e a biogênese mitocondrial em resposta à depleção do mtDNA. (2025) Revista de Biologia Celular. 224(3). DOI: 10.1083/jcb.202311082

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Varanasi, SK, Chen, D., Liu, Y., Johnson, MA, Miller, CM, Ganguly, S., Lande, K., LaPorta, MA, Hoffmann, FA, Mann, TH, Teneche, MG, Casillas, E., Mangalhara, KC, Mathew, V., Sun, M., Jensen, IJ, Farsakoglu, Y., Chen, T., Parisi, B., Deota, S., Havas, A., Lee, J., Chung, HK, Schietinger, A., Panda, S., Williams, AE, Farber, DL, Dhar, D., Adams, PD, Feng, GS, Shadel, GS, Sundrud, MS, Kaech, SM A síntese de ácido biliar impede respostas de células T específicas do tumor durante o câncer de fígado. (2025) Ciência. 387(6730):192-201. DOI: 10.1126/science.adl4100

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2024

Schiavon, CR, Wang, Y., Feng, JW, Garrett, S., Sung, TC, Dayn, Y., Wang, C., Youle, RJ, Quintero-Carmona, OA, Shadel, GS, Solar, U. A polimerização de actina mediada por INF2 em contatos de organelas ER regula o tamanho e o movimento das organelas. (2024) Res Quad. DOI: 10.21203/rs.3.rs-4720604/v1

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Phang, HJ, Heimler, SR, Scandalis, LM, Wing, D., Moran, R., Nichols, JF, Moreno, D., Shadel, GS, Gage, FH, Molina, AJA Protocolo para a Coorte Clínica do San Diego Nathan Shock Center: um novo recurso para estudos do envelhecimento humano. (2024) BMJ Open. 14(6):e082659. DOI: 10.1136/bmjopen-2023-082659

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Maxwell, MB, Hom-Tedla, MS, Yi, J., Li, S., Rivera, SA, Yu, J., Burns, MJ, McRae, HM, Stevenson, BT, Coakley, KE, Ho, J., Gastelum, KB, Bell, JC, Jones, AC, Eskander, RN, Dykhuizen, CE, Shadel, GS, Kaech, SM, Hargreaves, DC ARID1A suprime a ativação da via de interferon tipo I mediada por alça R da imunidade antitumoral. (2024) Célula DOI: 10.1016/j.cell.2024.04.025

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Newman, LE, Weiser Novak, S., Rojas, GR, Tadepalle, N., Schiavon, CR, Grotjahn, DA, Towers, CG, Tremblay, M., Donnelly, MP, Ghosh, S., Medina, M., Rocha, S., Rodriguez-Enriquez, R., Chevez, JA, Lemersal, I., Manor, U., Shadel, GS O estresse de replicação do DNA mitocondrial desencadeia uma via endossômica pró-inflamatória de eliminação de nucleóides. (2024) Natureza Biologia Celular. DOI: 10.1038/s41556-023-01343-1

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O DNA mitocondrial (mtDNA) codifica subunidades essenciais do sistema de fosforilação oxidativa, mas também é um importante padrão molecular associado a danos (DAMP) que envolve sensores imunológicos inatos quando liberado no citoplasma, fora das células ou na circulação. Como DAMP, o mtDNA não só contribui para a resistência antiviral, mas também causa inflamação patogênica em muitos contextos de doenças. Células que sofrem estresse de mtDNA causado pela depleção da proteína de empacotamento de mtDNA, fator de transcrição A, mitocondrial (TFAM) ou durante a infecção pelo vírus herpes simplex-1 exibem mitocôndrias alongadas, aumento de nucleóides (complexos de proteína mtDNA) e ativação de cGAS-STING inato sinalização imunológica via mtDNA liberado no citoplasma. No entanto, a relação entre mitocôndrias aberrantes e dinâmica de nucleóides, liberação de mtDNA e ativação de cGAS-STING permanece obscura. Aqui mostramos que, sob uma variedade de condições de estresse de replicação do mtDNA e durante a infecção pelo vírus herpes simplex-1, nucleóides aumentados que permanecem ligados ao TFAM saem das mitocôndrias. Os nucleóides aumentados surgem do estresse de replicação do mtDNA, o que causa o agrupamento de nucleóides por meio de um bloqueio na fissão mitocondrial em um estágio em que a polimerização da actina do retículo endoplasmático normalmente começaria, definindo um ponto de verificação de fissão que garante que o mtDNA completou a replicação e é competente para a segregação nas mitocôndrias filhas. O envolvimento crônico desse ponto de verificação resulta no tráfico aumentado de nucleóides para endossomos iniciais e tardios para descarte. A ruptura endossomal durante o trânsito através desta via endossomal causa, em última análise, a ativação de cGAS-STING mediada por mtDNA. Assim, propomos que os nucleóides incompetentes para replicação sejam eliminados seletivamente por uma via adaptativa de controle de qualidade mitocôndria-endossomal que é propensa à ativação do sistema imunológico inato, o que pode representar um alvo terapêutico para prevenir a inflamação mediada pelo mtDNA durante a infecção viral e outros estados patogênicos.

2023

Victorelli, S., Salmonowicz, H., Chapman, J., Martini, H., Vizioli, MG, Riley, JS, Cloix, C., Hall-Younger, E., Machado Espindola-Netto, J., Jurk, D., Lagnado, AB, Sales Gomez, L., Farr, JN, Saul, D., Reed, R., Kelly, G., Eppard, M., Greaves, LC, Dou, Z., Pirius, N. , Szczepanowska, K., Porritt, RA, Huang, H., Huang, TY, Mann, DA, Masuda, CA, Khosla, S., Dai, H., Kaufmann, SH, Zacharioudakis, E., Gavathiotis, E. , LeBrasseur, NK, Lei, X., Sainz, AG, Korolchuk, VI, Adams, PD, Shadel, GS, Tait, SWG, Passos, JF O estresse apoptótico causa a liberação de mtDNA durante a senescência e impulsiona o SASP. (2023) Natureza. DOI: 10.1038/s41586-023-06621-4

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Mangalhara, KC, Varanasi, SK, Johnson, MA, Burns, MJ, Rojas, GR, Esparza Moltó, PB, Sainz, AG, Tadepalle, N., Abbott, KL, Mendiratta, G., Chen, D., Farsakoglu, Y., Kunchok, T., Hoffmann, FA, Parisi, B., Rincon, M., Vander Heiden, MG, Bosenberg, M., Hargreaves, DC, Kaech, SM, Shadel, GS A manipulação do fluxo de elétrons mitocondriais aumenta a imunogenicidade do tumor. (2023) Ciência. 381(6664):1316-1323. DOI: 10.1126/science.abq1053

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Lei, Y., VanPortfliet, JJ, Chen, YF, Bryant, JD, Li, Y., Fails, D., Torres-Odio, S., Ragan, KB, Deng, J., Mohan, A., Wang, B., Brahms, ON, Yates, SD, Spencer, M., Tong, CW, Bosenberg, MW, West, LC, Shadel, GS, Shutt, TE, Upton, JW, Li, P., West, AP A detecção cooperativa de DNA mitocondrial por ZBP1 e cGAS promove cardiotoxicidade. (2023) Célula DOI: 10.1016/j.cell.2023.05.039

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Al Khatib, I., Deng, J., Lei, Y., Torres-Odio, S., Rojas, GR, Newman, LE, Chung, BK, Symes, A., Zhang, H., Huang, SN, Pommier , Y., Khan, A., Shadel, GS, West, AP, Gibson, WT, Shutt, TE Ativação da resposta imune inata cGAS-STING em células com topoisomerase mitocondrial deficiente TOP1MT. (2023) Genética Molecular Humana. DOI: 10.1093/hmg/ddad062

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Malik, N., Ferreira, BI, Hollstein, PE, Curtis, SD, Trefts, E., Weiser Novak, S., Yu, J., Gilson, R., Hellberg, K., Fang, L., Sheridan, A., Hah, N., Shadel, GS, Manor, U., Shaw, RJ Indução da biogênese lisossômica e mitocondrial por fosforilação de AMPK de FNIP1. (2023) Ciência. 380(6642):eabj5559. DOI: 10.1126/science.abj5559

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Newman, LE, Shadel, GS Liberação de DNA mitocondrial na sinalização imune inata. (2023) Revisão Anual de Bioquímica. DOI: 10.1146/annurev-biochem-032620-104401

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Nassour, J., Aguiar, LG, Correia, A., Schmidt, T., Mainz, L., Przetocka, S., Haggblom, C., Tadepalle, N., Williams, A., Shokhirev, MN, Akincilar, SC, Tergaonkar, V., Shadel, S., Karlseder, J. A sinalização dos telômeros para as mitocôndrias por ZBP1 medeia a crise replicativa (2023) Natureza. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05710-8

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2022

Cobo, I., Tanaka, TN, Chandra Mangalhara, K., Lana, A., Yeang, C., Han, C., Schlachetzki, J., Challcombe, J., Fixsen, BR, Sakai, M., Li , RZ, Fields, H., Mokry, M., Tsai, RG, Bejar, R., Prange, K., de Winther, M., Shadel, GS, Vidro, CK DNA metiltransferase 3 alfa e TET metilcitosina dioxigenase 2 restringem a sinalização de interferon mediada por DNA mitocondrial em macrófagos. (2022) Imunidade. DOI: 10.1016/j.immuni.2022.06.022

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Hancock-Cerutti, W., Wu, Z., Xu, P., Yadavalli, N., Leonzino, M., Tharkeshwar, AK, Ferguson, SM, Shadel, GS, De Camilli, P. A proteína de transferência de lipídios do ER-lisossoma VPS13C/PARK23 previne a sinalização aberrante de STING dependente de mtDNA (2022) Revista de Biologia Celular. 221(7):e202106046. DOI: DOI: 10.1083/jcb.202106046

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Xian, H., Watari, K., Sanchez-Lopez, E., Offenberger, J., Onyuru, J., Sampath, H., Ying, W., Hoffman, HM, Shadel, GS, Karine, M. Os fragmentos de DNA oxidados saem da mitocôndria por meio de canais dependentes de mPTP e VDAC para ativar a sinalização do inflamassoma NLRP3 e do interferon. (2022) Imunidade. DOI: 10.1016/j.immuni.2022.06.007

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Hepokoski, ML, Odish, MF, Lam, MT, Coufal, NG, Rolfsen, ML, Shadel, GS, Moyzis, AG, Sainz, AG, Takiar, PG, Patel, S., Leonard, AJ, Samandari, N., Hansen, E., Trescott, S., Nguyen, C., Jepsen, K., Cutter, G ., Gillespie, MN, Spragg, RG, Sasik, R., Ix, JH A quantificação absoluta do DNA mitocondrial plasmático por PCR digital de gotículas marca a gravidade da COVID-19 ao longo do tempo durante as admissões na unidade de terapia intensiva. (2022) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. DOI: 10.1152/ajplung.00128.2022

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O aumento das concentrações plasmáticas de DNA mitocondrial está associado a resultados ruins em várias doenças críticas, incluindo COVID-19. No entanto, os métodos atuais de quantificação de DNA mitocondrial livre de células no plasma são demorados e carecem de reprodutibilidade. Aqui, usamos o sequenciamento de próxima geração para caracterizar o tamanho e a localização do genoma do DNA mitocondrial circulante em indivíduos gravemente doentes com COVID-19 para desenvolver um método fácil e ideal de quantificação por PCR digital de gotículas. O sequenciamento revelou uma grande porcentagem de pequenos fragmentos de DNA mitocondrial no plasma com ampla variabilidade na cobertura por localização do genoma. Identificamos sondas para os genes do DNA mitocondrial, citocromo B e NADH desidrogenase 1, em regiões de cobertura relativamente alta que visam pequenas sequências potencialmente perdidas por outros métodos. Avaliações seriadas das concentrações absolutas de DNA mitocondrial foram então determinadas no plasma de 20 indivíduos gravemente doentes com COVID-19 sem uma etapa de isolamento de DNA. As concentrações de DNA mitocondrial no dia da inscrição aumentaram significativamente em pacientes com síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) moderada ou grave em comparação com aqueles sem SDRA ou com SDRA leve. As comparações das concentrações de DNA mitocondrial ao longo do tempo entre pacientes com SDRA leve/sem sobrevivência, pacientes com SDRA moderada/grave que sobreviveram e não sobreviventes mostraram as concentrações mais altas em pacientes com doença mais grave. A quantificação absoluta do DNA mitocondrial por PCR digital de gotículas é eficiente em termos de tempo e reprodutível; assim, fornecemos uma ferramenta valiosa e justificativa para estudos futuros que avaliam o DNA mitocondrial como um biomarcador em tempo real para orientar a tomada de decisões clínicas em indivíduos gravemente doentes com COVID-19.

2021

Shadel, GS, Adams, PD, Berggren, WT, Diedrich, JK, Diffenderfer, KE, Gage, FH, Hah, N., Hansen, M., Hetzer, MW, Molina, AJA, Manor, U., Marek, K., O 'Keefe, DD, Pinto, AFM, Sacco, A., Sharpee, TO, Shokriev, MN, Zambetti, S. San Diego Nathan Shock Center: enfrentando a heterogeneidade do envelhecimento. (2021) Gerociência. DOI: 10.1007 / s11357-021-00426-x

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A compreensão dos mecanismos básicos do envelhecimento é uma grande promessa para o desenvolvimento de intervenções que previnam ou retardem muitos declínios e doenças relacionados à idade simultaneamente para aumentar a expectativa de vida humana. No entanto, um importante fator de confusão na pesquisa do envelhecimento é a heterogeneidade do próprio processo de envelhecimento. No nível do organismo, fica claro que a idade cronológica nem sempre prediz a idade biológica ou a suscetibilidade à fragilidade ou patologia. Embora a genética e o ambiente sejam os principais fatores que impulsionam as taxas variáveis de envelhecimento, surge uma complexidade adicional porque diferentes órgãos, tecidos e tipos de células são intrinsecamente heterogêneos e exibem diferentes trajetórias de envelhecimento normalmente ou em resposta ao estresse do processo de envelhecimento (por exemplo, acúmulo de danos). . Lidar com a heterogeneidade do envelhecimento requer ferramentas novas e especializadas (por exemplo, análises de célula única, abordagens baseadas em espectrometria de massa e imagens avançadas) para identificar novas assinaturas de envelhecimento em todas as escalas. Abordagens computacionais de ponta são necessárias para integrar esses conjuntos de dados díspares e elucidar as interações de rede entre marcas de envelhecimento conhecidas. Há também a necessidade de modelos de envelhecimento baseados em células humanas aprimorados para garantir que os resultados da pesquisa básica sejam relevantes para o envelhecimento humano e as intervenções de saúde. O San Diego Nathan Shock Center (SD-NSC) fornece acesso a recursos científicos de ponta para facilitar o estudo da heterogeneidade do envelhecimento em geral e promover o uso de novos modelos de células humanas de envelhecimento. O centro também possui um Núcleo de Desenvolvimento de Pesquisa robusto que financia projetos-piloto sobre a heterogeneidade do envelhecimento e organiza atividades de treinamento inovadoras, incluindo workshops e um programa de orientação personalizado, para ajudar os pesquisadores novos no campo do envelhecimento. Finalmente, o SD-NSC participa de atividades de divulgação para educar a comunidade em geral sobre a importância da pesquisa sobre envelhecimento e promover a necessidade de pesquisas básicas sobre biologia do envelhecimento em particular.

Wu, Z., Sainz, AG, Shadel, GS DNA mitocondrial: sentinela do estresse genotóxico celular. (2021) Tendências em Ciências Bioquímicas. DOI: 10.1016/j.tibs.2021.05.004

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Tadepalle, N., Shadel, GS O RNA relata as últimas notícias das mitocôndrias. (2021) Célula Molecular. 81(9):1863-1865. DOI: 10.1016/j.molcel.2021.04.005

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Lei, Y., Zhang, J., Schiavon, CR, He, M., Chen, L., Shen, H., Zhang, Y., Yin, Q., Cho, Y., Andrade, L., Shadel, GS, Hepokoski, M., Lei, T., Wang, H., Zhang, J., Yuan, JX, Malhotra, A., Manor, U., Wang, S., Yuan, ZY, Shyy, JY A proteína de pico SARS-CoV-2 prejudica a função endotelial por meio da regulação negativa de ACE2. (2021) Pesquisa de circulação. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318902

Schwartz, RE, Shokhirev, MN, Andrade, LR, Gutkind, JS, Iglesias-Bartolome, R., Shadel, GS Insights sobre a senescência de células epiteliais a partir da análise de transcriptoma e secretoma de queratinócitos orais humanos. (2021) Envelhecimento. 13. DOI: 10.18632/aging.202658

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Schiavon, CR, Shadel, GS, Solar, U. Mobilidade mitocondrial prejudicada na doença de Charcot-Marie-Tooth. (2021) Front Cell Dev Biol. 9:624823. DOI: 10.3389/fcell.2021.624823

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2020

Schiavon, CR, Zhang, T., Zhao, B., Moore, AS, Wales, P., Andrade, LR, Wu, M., Sung, TC, Dayn, Y., Feng, JW, Quintero, OA, Shadel, GS, Grosse, R., Manor, U. A imagem do cromocorpo de actina revela a dinâmica da actina suborganelar. (2020) Métodos da natureza. DOI: 10.1038/s41592-020-0926-5

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2019

Wu, Z., Oeck, S., West, AP, Mangalhara, KC, Sainz, AG, Newman, LE, Zhang, XO, Wu, L., Yan, Q., Bosenberg, M., Liu, Y., Sulkowski, PL, Tripple, V., Kaech, SM, Glazer, PM, Shadel, GS A sinalização de estresse do DNA mitocondrial protege o genoma nuclear. [Publicado] (2019) Metabolismo da Natureza. 1(12):1209-1218. DOI: 10.1038/s42255-019-0150-8

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Gale, M., Li, Y., Cao, J., Liu, ZZ, Holmbeck, MA, Zhang, M., Lang, SM, Wu, L., Do Carmo, M., Gupta, S., Aoshima, K., DiGiovanna, MP, Stern, DF, Rimm, DL, Shadel, GS, Chen, X., Yan, Q. A resistência adquirida às terapias direcionadas ao HER2 cria vulnerabilidade à inibição da ATP sintase. (2019) Pesquisa sobre câncer. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3985

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Harel, M., Ortenberg, R., Varanasi, SK, Mangalhara, KC, Mardamshina, M., Markovits, E., Baruch, EN, Tripple, V., Arama-Chayoth, M., Greenberg, E., Shenoy , A., Ayasun, R., Knafo, N., Xu, S., Anafi, L., Yanovich-Arad, G., Barnabas, GD, Ashkenazi, S., Besser, MJ, Schachter, J., Bosenberg , M., Shadel, GS, Barshack, I., Kaech, SM, Markel, G., Geiger, T. Proteômica da Resposta do Melanoma à Imunoterapia Revela Dependência Mitocondrial. (2019) Célula DOI: 10.1016/j.cell.2019.08.012

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2018

Mangalhara, KC, Shadel, GS Um peptídeo derivado da mitocôndria exerce a opção nuclear. (2018) Metabolismo celular. 28(3):330-331. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.08.017

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Newman, LE, Shadel, GS Pink1/Parkin liga inflamação, estresse mitocondrial e neurodegeneração. (2018) Revista de Biologia Celular. 217(10):3327-3329. DOI: 10.1083/jcb.201808118

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Cox, CS, McKay, SE, Holmbeck, MA, Christian, BE, Scortea, AC, Tsay, AJ, Newman, LE, Shadel, GS Mitohormese em camundongos via ativação basal sustentada de sinalização mitocondrial e antioxidante. (2018) Metabolismo celular. 28(5):776-786. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.07.011

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Wu, L., Cao, J., Cai, WL, Lang, SM, Horton, JR, Jansen, DJ, Liu, ZZ, Chen, JF, Zhang, M., Mott, BT, Pohida, K., Rai, G., Kales, SC, Henderson, MJ, Hu, X., Jadhav, A., Maloney, DJ, Simeonov, A., Zhu, S., Iwasaki, A., Hall, MD, Cheng, X., Shadel, GS, Yan, Q. As histonas desmetilases KDM5 reprimem a resposta imune via supressão de STING. (2018) PLOS Biologia. 16(8):e2006134. DOI: 10.1371/journal.pbio.2006134

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Zhang, Y., Lee, JH, Paull, TT, Gehrke, S., D'Alessandro, A., Dou, Q., Gladyshev, VN, Schroeder, EA, Steyl, SK, Christian, BE, Shadel, GS A detecção redox mitocondrial pela quinase ATM mantém a capacidade antioxidante celular. (2018) Sinalização Científica. 11(538). DOI: 10.1126/scisignal.aaq0702

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As mitocôndrias são parte integrante do metabolismo energético celular e da produção de ATP e estão envolvidas na regulação de muitos processos celulares. As mitocôndrias produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), que não só podem danificar os componentes celulares, mas também participar da transdução de sinal. A quinase ATM, que sofre mutação na doença neurodegenerativa autossômica recessiva ataxia-telangiectasia (AT), é um elemento-chave na resposta ao dano do DNA nuclear. No entanto, o ATM também executa uma função de detecção redox mediada pela formação de dímeros ligados por dissulfeto dependentes de ROS. Descobrimos que o peróxido de hidrogênio derivado da mitocôndria promoveu a dimerização da ATM. Nas células HeLa, os dímeros ATM foram localizados no núcleo e inibidos pela proteína reguladora redox tiorredoxina 1 (TRX1), sugerindo a existência de um relé de sinalização de estresse mediado por ROS das mitocôndrias para o núcleo. A formação do dímero ATM não afetou sua associação com a cromatina na ausência ou presença de dano nuclear ao DNA, consistente com a separação de suas funções redox e sinalização de dano ao DNA. A análise comparativa de células U2OS expressando ATM de tipo selvagem ou o mutante C2991L deficiente em detecção redox revelou que uma função da detecção redox ATM é promover o fluxo de glicose através da via das pentoses fosfato (PPP), aumentando a abundância e a atividade da glicose-6 -fosfato desidrogenase (G6PD), aumentando assim a capacidade antioxidante celular. O PPP produz a coenzima NADPH necessária para uma resposta antioxidante robusta, incluindo a regeneração do TRX1, indicando a existência de um loop de feedback regulatório envolvendo ATM e TRX1. Propomos que a perda da função de detecção de ROS mitocondrial da ATM pode causar acúmulo de ROS celular e estresse oxidativo na AT.

Kuszak, AJ, Espey, MG, Falk, MJ, Holmbeck, MA, Manfredi, G., Shadel, GS, Vernon, HJ, Zolkipli-Cunningham, Z. Intervenções Nutricionais para Deficiências OXPHOS Mitocondriais: Mecanismos e Sistemas Modelo. (2018) Revisão Anual de Patologia. 13(163-191):163-191. DOI: 10.1146/annurev-pathol-020117-043644

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2017

Oeste, AP, Shadel, GS DNA mitocondrial em respostas imunes inatas e patologia inflamatória. (2017) Avaliações da natureza. Imunologia. 17(6):363-375. DOI: 10.1038/nri.2017.21

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Schweppe, DK, Chavez, JD, Lee, CF, Caudal, A., Kruse, SE, Stuppard, R., Marcinek, DJ, Shadel, GS, Tian, R., Bruce, JE Interatoma de proteína mitocondrial elucidado por espectrometria de massa de reticulação química. (2017) Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 114(7):1732-1737. DOI: 10.1073/pnas.1617220114

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2016

Oran, AR, Adams, CM, Zhang, XY, Gennaro, VJ, Pfeiffer, HK, Mellert, HS, Seidel, HE, Mascioli, K., Kaplan, J., Gaballa, MR, Shen, C., Rigoutsos, I ., King, MP, Cotney, JL, Arnold, JJ, Sharma, SD, Martinez-Outschoorn, UE, Vakoc, CR, Chodosh, LA, Thompson, JE, Bradner, JE, Cameron, CE, Shadel, GS, Eischen, CM, McMahon, SB O controle multifocal da expressão gênica mitocondrial por MYC oncogênico fornece potenciais alvos terapêuticos no câncer. (2016) Oncotarget. 7(45):72395-72414. DOI: 10.18632/oncotarget.11718

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Kang, MJ, Shadel, GS Uma Perspectiva Mitocondrial da Patogênese da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica. (2016) Tuberculose e Doenças Respiratórias. 79(4):207-213. DOI: 10.4046/trd.2016.79.4.207

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Holmbeck, MA, Shadel, GS As mitocôndrias fornecem uma solução 'complexa' para um problema bacteriano. (2016) Natureza Imunologia. 17(9):1009-10. DOI: 10.1038/ni.3534

Nouws, J., Goswami, AV, Bestwick, M., McCann, BJ, Surovtseva, YV, Shadel, GS A proteína ribossomal mitocondrial L12 é necessária para a estabilidade do POLRMT e existe como duas formas geradas por proteólise alternativa durante a importação. (2016) Jornal de Química Biológica. 291(2):989-97. DOI: 10.1074/jbc.M115.689299

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McKay, SE, Yan, W., Nouws, J., Thormann, MJ, Raimundo, N., Khan, A., Santos-Sacchi, J., Song, L., Shadel, GS Patologia auditiva em um modelo de camundongo mtTFB1 transgênico de surdez mitocondrial. (2015) Sou. J. Pathol. 185(12):3132-40. DOI: 10.1016/j.ajpath.2015.08.014

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Camell, CD, Nguyen, KY, Jurczak, MJ, Christian, BE, Shulman, GI, Shadel, GS, Dixit, VD A nova síntese de ceramida específica para macrófagos é dispensável para inflamação induzida por inflamassoma e resistência à insulina na obesidade. (2015) Jornal de Química Biológica. 290(49):29402-13. DOI: 10.1074/jbc.M115.680199

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A sobrecarga lipídica dietética e o excesso calórico durante a obesidade é um estado inflamatório crônico de baixo grau com capacidade diminuída de metabolizar adequadamente a glicose ou os lipídios. Os macrófagos são críticos na manutenção da homeostase do tecido adiposo, em parte pela regulação do metabolismo lipídico, homeostase energética e remodelação tecidual. Durante a obesidade induzida por dieta rica em gordura, os macrófagos são ativados por "sinais de perigo" derivados de lipídios, como ceramidas e palmitato, e promovem a inflamação do tecido adiposo de maneira dependente do inflamassoma Nlrp3. Dado que o destino metabólico dos ácidos graxos nos macrófagos não está totalmente elucidado, levantamos a hipótese de que a síntese de novo de ceramida, através da enzima limitante de velocidade serina palmitoiltransferase de cadeia longa (Sptlc)-2, é necessária para Nlrp3 dirigido por ácidos graxos saturados ativação do inflamassoma em macrófagos. Aqui relatamos que a superexpressão mitocondrial de catalase, que é estabelecida para mitigar o estresse oxidativo, controla a ativação do inflamassoma Nlrp3 induzida por ceramida, mas não afeta a clivagem da caspase-1 mediada por ATP. Surpreendentemente, a deleção específica de células mieloides de Sptlc2 não é necessária para a ativação do inflamassoma Nlrp3 acionada por palmitato. Além disso, a ablação de Sptlc2 em macrófagos não afetou a polarização dos macrófagos ou a leucocitose do tecido adiposo induzida pela obesidade. Consistente com esses dados, a investigação da resistência à insulina usando grampos euglicêmicos hiperinsulinêmicos não revelou diferenças significativas em camundongos obesos sem maquinaria de síntese de novo de ceramida em macrófagos. Esses dados sugerem que vias metabólicas alternativas controlam a síntese de ceramidas derivadas de ácidos graxos em macrófagos e a ativação do inflamassoma Nlrp3 na obesidade.

Shadel, GS, Horvath, TL Sinalização ROS mitocondrial na homeostase do organismo. (2015) Célula 163(3):560-9. DOI: 10.1016/j.cell.2015.10.001

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Longo, VD, Antebi, A., Bartke, A., Barzilai, N., Brown-Borg, HM, Caruso, C., Curiel, TJ, de Cabo, R., Franceschi, C., Gems, D., Ingram, DK, Johnson, TE, Kennedy, BK, Kenyon, C., Klein, S., Kopchick, JJ, Lepperdinger, G., Madeo, F., Mirisola, MG, Mitchell, JR, Passarino, G., Rudolph , KL, Sedivy, JM, Shadel, GS, Sinclair, DA, Spindler, SR, Suh, Y., Vijg, J., Vinciguerra, M., Fontana, L. Intervenções para retardar o envelhecimento em humanos: estamos prontos? (2015) Célula de Envelhecimento. 14(4):497-510. DOI: 10.1111/acel.12338

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Kang, MJ, Yoon, CM, Kim, BH, Lee, CM, Zhou, Y., Sauler, M., Homer, R., Dhamija, A., Boffa, D., West, AP, Shadel, GS, Ting, JP, Tedrow, JR, Kaminski, N., Kim, WJ, Lee, CG, Oh, YM, Elias, JA Supressão de NLRX1 na doença pulmonar obstrutiva crônica. (2015) Revista de Investigação Clínica. 125(6):2458-62. DOI: 10.1172/JCI71747

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Clayton, DA, Shadel, GS Purificação de mitocôndrias por centrifugação de gradiente de densidade degrau de sacarose. (2014) Protocolos Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080028. DOI: 10.1101/pdb.prot080028

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Clayton, DA, Shadel, GS Isolamento de mitocôndrias de tecido animal. (2014) Protocolos Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080010. DOI: 10.1101/pdb.prot080010

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Clayton, DA, Shadel, GS Isolamento de mitocôndrias de células de cultura de tecidos. (2014) Protocolos Cold Spring Harbor. 2014(10):pdb.prot080002. DOI: 10.1101/pdb.prot080002

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Agora, J., Shadel, GS microgestão da tradução mitocondrial. (2014) Célula 158(3):477-8. DOI: 10.1016/j.cell.2014.07.010

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Shadel, GS Viva mais em MARS: um paradigma de levedura da sinalização ROS adaptativa mitocondrial no envelhecimento. (2014) Célula Microbiana. 1(5):140-144. DOI: 10.15698/mic2014.05.143

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Mannam, P., Shinn, AS, Srivastava, A., Neamu, RF, Walker, WE, Bohanon, M., Merkel, J., Kang, MJ, Dela Cruz, CS, Ahasic, AM, Pisani, MA, Trentalange , M., Oeste, AP, Shadel, GS, Elias, JA, Lee, PJ MKK3 regula a biogênese mitocondrial e a mitofagia na lesão pulmonar induzida por sepse. (2014) Sou. J. Physiol. Pulmão Célula Mol. Physiol. 306(7):L604-19. DOI: 10.1152/ajplung.00272.2013

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Raimundo, N., Song, L., Shutt, TE, McKay, SE, Cotney, J., Guan, MX, Gilliland, TC, Hohuan, D., Santos-Sacchi, J., Shadel, GS O estresse mitocondrial envolve a sinalização apoptótica E2F1 para causar surdez. (2012) Célula 148(4):716-26. DOI: 10.1016/j.cell.2011.12.027

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Woo, DK, Green, PD, Santos, JH, D'Souza, AD, Walther, Z., Martin, WD, Christian, BE, Chandel, NS, Shadel, GS A instabilidade do genoma mitocondrial e ROS aumentam a tumorigênese intestinal em camundongos APC(Min/+). (2012) Sou. J. Pathol. 180(1):24-31. DOI: 10.1016/j.ajpath.2011.10.003

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Malarkey, CS, Bestwick, M., Kuhlwilm, JE, Shadel, GS, Churchill, EU A ativação da transcrição pelo fator A de transcrição mitocondrial envolve a distorção preferencial do DNA do promotor. (2012) Pesquisa de Ácidos Nucleicos. 40(2):614-24. DOI: 10.1093/nar/gkr787

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Liu, L., Sanosaka, M., Lei, S., Bestwick, ML, Frey, JH, Surovtseva, YV, Shadel, GS, Cooper, MP A proteína LRP130 remodela as mitocôndrias e estimula a oxidação de ácidos graxos. (2011) Jornal de Química Biológica. 286(48):41253-64. DOI: 10.1074/jbc.M111.276121

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Surovtseva, YV, Shutt, TE, Cotney, J., Cimen, H., Chen, SY, Koc, EC, Shadel, GS A proteína ribossômica mitocondrial L12 associa-se seletivamente com a polimerase de RNA mitocondrial humana para ativar a transcrição. (2011) Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 108(44):17921-6. DOI: 10.1073/pnas.1108852108

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A transcrição basal do DNA mitocondrial humano (mtDNA) in vitro requer a subunidade única, polimerase de RNA relacionada a bacteriófagos, POLRMT e fator de transcrição h-mtTFB2. Este sistema de dois componentes é ativado diferencialmente nos promotores do mtDNA pelo fator A de transcrição mitocondrial humano (h-mtTFA). A proteína ribossômica mitocondrial L7/L12 (MRPL12) liga-se diretamente ao POLRMT, mas não se sabe se o faz no contexto do ribossomo ou como uma proteína "livre" na matriz. Além disso, a evidência existente de que MRPL12 ativa a transcrição mitocondrial deriva de estudos de superexpressão em células cultivadas e experimentos de transcrição usando lisados mitocondriais brutos, impedindo efeitos diretos de MRPL12 na transcrição a serem atribuídos. Aqui, relatamos que a depleção de MRPL12 de células HeLa por shRNA resulta em diminuição dos níveis de estado estacionário de transcritos mitocondriais, que não são contabilizados por alterações na estabilidade do RNA. Também mostramos que existe um pool "livre" significativo de MRPL12 em mitocôndrias humanas não associadas a ribossomos. MRPL12 "livre" se liga seletivamente a POLRMT in vivo em um complexo distinto daqueles contendo h-mtTFB2. Finalmente, usando um sistema de transcrição mitocondrial totalmente recombinante, demonstramos que MRPL12 estimula a transcrição dependente do promotor e independente do promotor diretamente in vitro. Com base nesses resultados, propomos que, quando não associado a ribossomos, MRPL12 tem uma segunda função na transcrição, talvez atuando para facilitar a transição da iniciação para o alongamento. Especulamos que este é um mecanismo para coordenar a biogênese e transcrição do ribossomo mitocondrial nas mitocôndrias humanas, onde a transcrição de rRNAs do mtDNA presumivelmente precisa ser ajustada de acordo com a taxa de importação e montagem dos MRPs codificados pelo núcleo em ribossomos.

Baysal, BE, McKay, SE, Kim, YJ, Zhang, Z., Alila, L., Willett-Brozick, JE, Pacak, K., Kim, TH, Shadel, GS Imprinting genômico em um elemento de fronteira flanqueando o locus SDHD. (2011) Genética Molecular Humana. 20(22):4452-61. DOI: 10.1093/hmg/ddr376

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Raimundo, N., Baysal, BE, Shadel, GS Revisitando o ciclo do TCA: sinalização para a formação do tumor. (2011) Tendências em Medicina Molecular. 17(11):641-9. DOI: 10.1016/j.molmed.2011.06.001

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Pan, Y., Schroeder, EA, Ocampo, A., Barrientos, A., Shadel, GS Regulação do tempo de vida cronológico da levedura por TORC1 via sinalização adaptativa de ROS mitocondrial. (2011) Metabolismo celular. 13(6):668-78. DOI: 10.1016/j.cmet.2011.03.018

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Oeste, AP, Shadel, GS, Gosh, S. Mitocôndrias em respostas imunes inatas. (2011) Avaliações da natureza. Imunologia. 11(6):389-402. DOI: 10.1038/nri2975

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Chatenay-Lapointe, M., Shadel, GS Repressão da tradução mitocondrial, respiração e um gene regulado pelo ciclo metabólico, SLF1, pela proteína da família Pumilio de levedura Puf3p. (2011) PLOS Um. 6(5):e20441. DOI: 10.1371/journal.pone.0020441

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West, AP, Brodsky, IE, Rahner, C., Woo, DK, Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, MC, Choi, Y., Shadel, GS, Gosh, S. A sinalização de TLR aumenta a atividade bactericida de macrófagos através de ROS mitocondriais. (2011) Natureza. 472(7344):476-80. DOI: 10.1038/nature09973

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Shutt, TE, Bestwick, M., Shadel, GS O núcleo do complexo de iniciação da transcrição mitocondrial humana: leva apenas dois para dançar o tango. (2011) Transcrição. 2(2):55-59. DOI: 10.4161/trns.2.2.14296

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Woo, DK, Shadel, GS Sinais de estresse mitocondrial revisam uma velha teoria do envelhecimento. (2011) Célula 144(1):11-2. DOI: 10.1016/j.cell.2010.12.023

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2010

Lee, HY, Choi, CS, Birkenfeld, AL, Alves, TC, Jornayvaz, FR, Jurczak, MJ, Zhang, D., Woo, DK, Shadel, GS, Ladiges, W., Rabinovitch, PS, Santos, JH, Petersen, KF, Samuel, VT, Shulman, GI A expressão direcionada da catalase para as mitocôndrias evita reduções associadas à idade na função mitocondrial e resistência à insulina. (2010) Metabolismo celular. 12(6):668-74. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.004

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Chatenay-Lapointe, M., Shadel, GS Mitocôndrias estressadas ficam MAD. (2010) Metabolismo celular. 12(6):559-60. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.018

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Shutt, TE, Lodeiro, MF, Cotney, J., Cameron, CE, Shadel, GS O aparelho central de transcrição mitocondrial humana é um sistema regulado de dois componentes in vitro. (2010) Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 107(27):12133-8. DOI: 10.1073/pnas.0910581107

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O aparato de transcrição mitocondrial humano central é atualmente considerado como um sistema obrigatório de três componentes compreendendo a polimerase de RNA mitocondrial relacionada ao bacteriófago T7, o fator de transcrição relacionado a rRNA metiltransferase, h-mtTFB2, e o fator de transcrição de caixa de grupo de alta mobilidade/fator de empacotamento de DNA , h-mtTFA/TFAM. Usando um sistema de transcrição mitocondrial humano recombinante fiel de Escherichia coli, demonstramos que a iniciação específica dos promotores do mtDNA, LSP e HSP1, requer apenas a RNA polimerase mitocondrial e h-mtTFB2 in vitro. Quando o h-mtTFA é adicionado a esses componentes basais, o LSP exibe um limiar muito mais baixo para ativação e uma resposta de amplitude maior do que o HSP1. Além disso, quando LSP e HSP1 estão juntos no mesmo modelo de transcrição, a transcrição independente de h-mtTFA de HSP1 e a transcrição dependente de h-mtTFA de ambos os promotores é aumentada e uma concentração mais alta de h-mtTFA é necessária para estimular HSP1. Os experimentos de competição do promotor revelaram que, além dos componentes de transcrição concorrentes do LSP longe do HSP1, sinais adicionais de ação cis estão envolvidos nesses aspectos da regulação do promotor. Com base nesses resultados, especulamos que o sistema de transcrição mitocondrial humano pode ter evoluído para regular diferencialmente o início da transcrição e a replicação do mtDNA iniciada pela transcrição em resposta à quantidade de h-mtTFA associado aos nucleoides, o que poderia começar a explicar a heterogeneidade da estrutura nucleoide e atividade in vivo. Além disso, este estudo lança uma nova luz sobre a evolução dos componentes da transcrição mitocondrial, mostrando que o sistema humano é um sistema regulado de dois componentes in vitro e, portanto, mais semelhante ao da levedura de brotamento do que se pensava anteriormente.

Fechar, TE, Shadel, GS Um compêndio da maquinaria de expressão gênica mitocondrial humana com links para doenças. (2010) Mutagênese Ambiental e Molecular. 51(5):360-79. DOI: 10.1002/em.20571

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Shadel, GS, Pã, Y. Regulação multifacetada de mitocôndrias por TOR. (2009) Ciclo de célula. 8(14):2143. DOI: 10.4161/cc.8.14.9117

Cotney, J., McKay, SE, Shadel, GS A elucidação de funções separadas, mas colaborativas, dos fatores de transcrição mitocondrial humano relacionados ao rRNA metiltransferase B1 e B2 na biogênese mitocondrial revela uma nova visão sobre o mate (2009) Genética Molecular Humana. 18(14):2670-82. DOI: 10.1093/hmg/ddp208

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Griffiths, LM, Doudican, NA, Shadel, GS, Doetsch, PW Dano oxidativo do DNA mitocondrial e mutagênese em Saccharomyces cerevisiae. (2009) Métodos em Biologia Molecular. 554:267-86. DOI: 10.1007/978-1-59745-521-3_17

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Crouser, ED, Shao, G., Julian, MW, Macre, JE, Shadel, GS, Tridandapani, S., Huang, Q., Wewers, MD A ativação de monócitos por células necróticas é promovida por proteínas mitocondriais e receptores de peptídeos formil. (2009) Medicina Intensiva. 37(6):2000-9. DOI: 10.1097/CCM.0b013e3181a001ae

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Suissa, S., Wang, Z., Poole, J., Wittkopp, S., Feder, J., Shutt, TE, Wallace, DC, Shadel, GS, Mismar, D. Antigas variantes genéticas do mtDNA modulam a transcrição e a replicação do mtDNA. (2009) Genética PLOS. 5(5):e1000474. DOI: 10.1371/journal.pgen.1000474

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Embora as consequências funcionais dos antecedentes genéticos do DNA mitocondrial (mtDNA) (haplótipos, haplogrupos) tenham sido demonstradas por estudos de associação de doenças e experimentos de cultura celular, não está claro quais mutações dentro do haplogrupo carregam implicações funcionais e quais são "evolutivas silenciosas". caroneiros". Nós nos propusemos a estudar a funcionalidade de mutações definidoras de haplogrupo dentro da região regulatória de transcrição/replicação do mtDNA por transcrição in vitro, levantando a hipótese de que mutações definidoras de haplogrupo ocorrendo dentro de motivos regulatórios de mtDNA poderiam afetar esses processos. Assim, rastreamos mais de 2500 mtDNAs humanos completos representando todas as principais populações em todo o mundo para variação natural em sítios de ligação de proteínas experimentalmente estabelecidos e regiões reguladoras compreendendo um total de 241 pb em cada mtDNA. Nossa triagem revelou 77/241 locais mostrando mutações pontuais que podem ser divididas em alterações não fixas (57/77, 74%) e haplogrupo/sub-haplogrupo (ou seja, alterações fixas na população, 20/77, 26%). A variante que define o haplogrupo caucasiano J (C295T) aumentou a ligação de TFAM (Electro Mobility Shift Assay) e a capacidade de transcrição in vitro da cadeia L, especialmente de um transcrito mais curto que mapeia imediatamente a montante do bloco de sequência conservada 1 (CSB1), um região associada com a iniciação do RNA da replicação do mtDNA. Consistente com esse achado, os cíbridos (ou seja, células que compartilham o mesmo fundo genético nuclear, mas diferem em seus antecedentes de mtDNA) que abrigam haplogrupo J mtDNA tiveram um aumento > 2 vezes no número de cópias de mtDNA, em comparação com cíbridos contendo haplogrupo H, sem diferenças aparentes em níveis estacionários de transcrições codificadas por mtDNA. Portanto, uma mutação na região reguladora do haplogrupo J afeta a replicação ou a estabilidade do mtDNA, o que pode explicar parcialmente o impacto fenotípico desse haplogrupo. Nossa análise demonstra, assim, pela primeira vez, o impacto funcional de determinadas mutações da região de controle definidora de haplogrupos do mtDNA, abrindo caminho para a avaliação da funcionalidade de variantes genéticas fixas e não fixas no genoma mitocondrial.

Lebedeva, MA, Eaton, JS, Shadel, GS A perda de p53 causa a depleção do DNA mitocondrial e altera a homeostase das espécies reativas de oxigênio mitocondrial. (2009) Biochimica et Biophysica Acta. 1787(5):328-34. DOI: 10.1016/j.bbabio.2009.01.004

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Pã, Y., Shadel, GS A extensão do tempo de vida cronológico pela sinalização reduzida de TOR requer regulação negativa de Sch9p e envolve aumento da densidade do complexo OXPHOS mitocondrial. (2009) Envelhecimento. 1(1):131-45. DOI: 10.18632/aging.100016

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Eaton, JS, Lin, ZP, Sartorelli, AC, Bonawitz, ND, Shadel, GS Ataxia-telangiectasia mutada quinase regula ribonucleotídeo redutase e homeostase mitocondrial. (2007) Revista de Investigação Clínica. 117(9):2723-34. DOI: 10.1172/JCI31604

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Lebedeva, MA, Shadel, GS As alterações induzidas pelo ciclo celular e pela ribonucleotídeo redutase no número de cópias do mtDNA influenciam a herança do mtDNA sem comprometer a expressão do gene mitocondrial. (2007) Ciclo de célula. 6(16):2048-57. DOI: 10.4161/cc.6.16.4572

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A maioria dos eucariontes mantém múltiplas cópias do mtDNA, variando de 20-50 em leveduras a até 10,000 em células de mamíferos. O genoma mitocondrial codifica subunidades essenciais da cadeia respiratória, mas o número de moléculas de mtDNA é aparentemente superior ao necessário para sustentar a respiração adequada, conforme evidenciado pelo "efeito limiar" nas doenças mitocondriais. Assim, outras pressões seletivas aparentemente contribuíram para a manutenção universal de múltiplas moléculas/célula de mtDNA. Aqui nós analisamos a interação entre as duas vias propostas para regular o número de cópias do mtDNA em Saccharomyces cerevisiae, e a exigência de um número normal de cópias do mtDNA para a expressão do gene mitocondrial, respiração e herança. Nós fornecemos a primeira evidência direta de que a regulação positiva do mtDNA pode ser alcançada aumentando a atividade da ribonucleotídeo redutase (RNR) via desrepressão da transcrição do gene RNR nuclear ou eliminação da regulação de feedback alostérico. A análise de cepas mutantes de rad53 também revelou regulação positiva do número de cópias do mtDNA independente daquela resultante da atividade RNR elevada. Apresentamos evidências de que um ciclo celular prolongado permite o acúmulo de mtDNA nessas cepas. A análise de várias cepas com mtDNA aumentado ou diminuído revelou que existem mecanismos para prevenir mudanças significativas na expressão gênica mitocondrial e na respiração diante de alterações de aproximadamente duas vezes no número de cópias do mtDNA. No entanto, a depleção de mtDNA em cepas nulas de abf2 leva a uma herança defeituosa de mtDNA que é parcialmente resgatada pela reposição de mtDNA via superexpressão de RNR1. Esses resultados indicam que um papel para várias cópias do mtDNA é garantir a herança ideal do mtDNA durante a divisão celular.

Bonawitz, ND, Shadel, GS Repensando a teoria mitocondrial do envelhecimento: o papel da expressão gênica mitocondrial na determinação da expectativa de vida. (2007) Ciclo de célula. 6(13):1574-8. DOI: 10.4161/cc.6.13.4457

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Cotney, J., Wang, Z., Shadel, GS Abundância relativa do sistema de transcrição mitocondrial humano e papéis distintos para h-mtTFB1 e h-mtTFB2 na biogênese mitocondrial e expressão gênica. (2007) Pesquisa de Ácidos Nucleicos. 35(12):4042-54. DOI: 10.1093/nar/gkm424

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Bonawitz, ND, Chatenay-Lapointe, M., Pan, Y., Shadel, GS A sinalização reduzida de TOR estende o tempo de vida cronológico por meio do aumento da respiração e da regulação positiva da expressão gênica mitocondrial. (2007) Metabolismo celular. 5(4):265-77. DOI: 10.1016/j.cmet.2007.02.009

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Wang, Z., Cotney, J., Shadel, GS A proteína ribossômica mitocondrial humana MRPL12 interage diretamente com a RNA polimerase mitocondrial para modular a expressão do gene mitocondrial. (2007) Jornal de Química Biológica. 282(17):12610-8. DOI: 10.1074/jbc.M700461200

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O núcleo da maquinaria de transcrição mitocondrial humana compreende uma única subunidade de RNA polimerase relacionada ao bacteriófago, POLRMT, a proteína de ligação ao DNA de caixa de grupo de alta mobilidade h-mtTFA/TFAM e duas proteínas coativadoras transcricionais, h-mtTFB1 e h-mtTFB2, que também têm atividade de rRNA metiltransferase. A recapitulação da iniciação específica da transcrição in vitro pode ser conseguida por um complexo de POL-RMT, h-mtTFA e h-mtTFB1 ou h-mtTFB2. No entanto, a natureza dos complexos de transcrição mitocondrial in vivo e o potencial envolvimento de proteínas adicionais no processo de transcrição em mitocôndrias humanas não foram extensivamente investigados. Em Saccharomyces cerevisiae, a transcrição e a tradução estão fisicamente acopladas através da formação de um complexo multiproteico nucleado pela ligação de Nam1p ao domínio amino-terminal da mtRNA polimerase (Rpo41p). Este paradigma de sistema modelo nos levou a procurar proteínas que interagem com POLRMT para regular a expressão gênica mitocondrial em humanos. Usando uma estratégia de captura por afinidade para identificar proteínas de ligação a POL-RMT, identificamos a proteína ribossomal mitocondrial L7/L12 (MRPL12) como uma proteína em extratos mitocondriais HeLa que interage especificamente com POLRMT in vitro. O MRPL12 recombinante purificado se liga ao POLRMT e estimula a atividade de transcrição mitocondrial in vitro, demonstrando que essa interação é direta e funcional. Finalmente, a partir de células HeLa que superexpressam MRPL12 marcado com epítopo FLAG, são observados níveis de estado estacionário aumentados de transcritos codificados por mtDNA e os complexos MRPL12-POLRMT podem ser co-imunoprecipitados, fornecendo fortes evidências de que essa interação aumenta a transcrição mitocondrial ou a estabilidade do RNA in vivo . Especulamos que a interação MRPL12 com POLRMT é provavelmente parte de um novo mecanismo regulatório que coordena a transcrição mitocondrial com tradução e/ou biogênese ribossomal durante a expressão gênica mitocondrial humana.

Zhang, H., Luo, Y., Zhang, W., He, Y., Dai, S., Zhang, R., Huang, Y., Bernatchez, P., Giordano, FJ, Shadel, G., Sessa, WC, Min, W. A expressão específica do endotélio da tiorredoxina mitocondrial melhora a função das células endoteliais e reduz as lesões ateroscleróticas. (2007) Sou. J. Pathol. 170(3):1108-20. DOI: 10.2353/ajpath.2007.060960

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Lin, ZP, Belcourt, MF, Carbone, R., Eaton, JS, Penketh, PG, Shadel, GS, Cory, JG, Sartorelli, AC O excesso de subunidades de ribonucleotídeo redutase R2 coordena o ponto de verificação da fase S para facilitar o reparo de danos ao DNA e a recuperação do estresse de replicação. (2007) Biochem. Pharmacol. 73(6):760-72. DOI: 10.1016/j.bcp.2006.11.014

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Fechar, TE, Shadel, GS Expandindo o interactoma mitocondrial. (2007) Biologia do Genoma. 8(2):203. DOI: 10.1186/gb-2007-8-2-203

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2006

Bonawitz, ND, Clayton, DA, Shadel, GS Iniciação e além: múltiplas funções da maquinaria de transcrição mitocondrial humana. (2006) Célula Molecular. 24(6):813-25. DOI: 10.1016/j.molcel.2006.11.024

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Cotney, J., Shadel, GS Evidência de um evento precoce de duplicação de genes na evolução da família B do fator de transcrição mitocondrial e manutenção da atividade de rRNA metiltransferase em mtTFB1 e mtTFB2 humanos. (2006) J. Mol. Evolução 63(5):707-17. DOI: 10.1007/s00239-006-0075-1

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A maioria dos metazoários tem dois genes nucleares que codificam ortólogos do bem caracterizado fator de transcrição mitocondrial Saccharomyces cerevisiae B (sc-mtTFB). Esta classe de fatores de transcrição é homóloga à família bacteriana KsgA de rRNA metiltransferases, que em Escherichia coli dimetila resíduos de adenina adjacentes em uma haste-alça do 16S rRNA. Essa modificação pós-transcricional é conservada na maioria dos rRNAs citoplasmáticos e mitocondriais dos metazoários. O fator de transcrição mitocondrial B1 do Homo sapiens (h-mtTFB1) possui essa atividade enzimática, implicando-o como uma proteína de dupla função envolvida na transcrição e tradução mitocondrial. Aqui demonstramos que h-mtTFB2 também tem atividade rRNA metiltransferase, mas é uma enzima menos eficiente do que h-mtTFB1. Em contraste, sc-mtTFB não possui atividade detectável de rRNA metiltransferase, correlacionando-se com a falta da modificação correspondente no rRNA mitocondrial da levedura em brotamento. Com base nesses resultados e nos relatos de que Drosophila melanogaster mtTFB1 e mtTFB2 não têm funções completamente sobrepostas, propomos um modelo para a regulação do mtDNA humano que leva em consideração que h-mtTFB1 e h-mtTFB2 provavelmente têm fator de transcrição parcialmente redundante e funções de rRNA metiltransferase. Finalmente, análises filogenéticas desta família de proteínas sugerem fortemente que a presença de dois homólogos de mtTFB em metazoários é o resultado de um evento de duplicação de genes que ocorreu no início da evolução eucariótica antes da divergência de fungos e metazoários. Este modelo sugere que, após o evento de duplicação gênica, ocorreram pressões seletivas diferenciais sobre as atividades do rRNA metiltransferase e do fator de transcrição dos genes mtTFB, com casos extremos culminando na perda de um dos genes parálogos em certas espécies.

Bonawitz, ND, Rodeheffer, MS, Shadel, GS A expressão gênica mitocondrial defeituosa resulta na inibição da respiração mediada por espécies reativas de oxigênio e redução do tempo de vida da levedura. (2006) Biologia Molecular e Celular. 26(13):4818-29. DOI: 10.1128/MCB.02360-05

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2005

O'Rourke, TW, Doudican, NA, Zhang, H., Eaton, JS, Doetsch, PW, Shadel, GS Envolvimento diferencial das helicases de DNA relacionadas Pif1p e Rrm3p na mutagênese pontual e estabilidade do mtDNA. (2005) Gene. 354:86-92. DOI: 10.1016/j.gene.2005.03.031

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Com exceção do reparo por excisão de base, vias e mecanismos conservados que mantêm a estabilidade do genoma mitocondrial permaneceram amplamente não delineados. Na levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, Pif1p é uma helicase de DNA única localizada tanto no núcleo quanto na mitocôndria, onde está envolvida na manutenção da integridade do DNA. Nós previamente elucidamos um papel para Pif1p na resistência ao dano oxidativo do mtDNA que parece ser distinto de sua função postulada na recombinação do mtDNA. Cepas sem Pif1p (pif1Delta) exibem uma taxa aumentada de formação de pequenos mutantes (um indicador de instabilidade do mtDNA) e mutagênese pontual elevada do mtDNA. Aqui, mostramos que a deleção do gene RRM3, que codifica uma helicase de DNA intimamente relacionada a Pif1p, resgata significativamente o fenótipo de indução pequena de uma cepa pif1Delta. No entanto, a supressão desse fenótipo não foi acompanhada por uma diminuição correspondente na mutagênese pontual do mtDNA. Em vez disso, a deleção de RRM3 sozinha resultou em um aumento na mutagênese pontual do mtDNA que foi sinérgica com a causada por uma mutação pif1Delta. Além disso, descobrimos que a superexpressão de RNR1, que codifica uma grande subunidade da ribonucleotídeo redutase (RNR), resgatou o fenótipo de indução pequena de uma mutação pif1Delta em uma extensão semelhante à deleção de RRM3. Isso, juntamente com nossa descoberta de que a proteína quinase Rad53p é fosforilada na cepa dupla mutante rrm3Delta pif1Delta, nos leva a concluir que um mecanismo pelo qual a deleção de RRM3 influencia a estabilidade do mtDNA é modulando pools de trifosfato de desoxinucleosídeo mitocondrial. Propomos que isso seja feito pela sinalização através da via conservada Mec1/Rad53, ponto de verificação da fase S para induzir a expressão e atividade de RNR. Ao todo, nossos resultados definem um novo papel para Rrm3p na função mitocondrial e indicam que Pif1p e Rrm3p influenciam um processo comum (ou processos) envolvidos na replicação, reparo ou estabilidade do mtDNA.

Shadel, GS DNA mitocondrial, a aconitase o 'embrulha'. (2005) Tendências em Ciências Bioquímicas. 30(6):294-6. DOI: 10.1016/j.tibs.2005.04.007

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Doudican, NA, Song, B., Shadel, GS, Doetsch, PW Dano oxidativo ao DNA causa instabilidade genômica mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae. (2005) Biologia Molecular e Celular. 25(12):5196-204. DOI: 10.1128/MCB.25.12.5196-5204.2005

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Taylor, SD, Zhang, H., Eaton, JS, Rodeheffer, MS, Lebedeva, MA, O'rourke, TW, Siede, W., Shadel, GS A via conservada do ponto de checagem nuclear Mec1/Rad53 regula o número de cópias do DNA mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae. (2005) Biologia molecular da célula. 16(6):3010-8. DOI: 10.1091/mbc.e05-01-0053

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2004

Shadel, GS Acoplamento da maquinaria de transcrição mitocondrial à doença humana. (2004) Tendências em Genética. 20(10):513-9. DOI: 10.1016/j.tig.2004.08.005

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Shadel, GS Um fator de transcrição mitocondrial de dupla função elimina a surdez. (2004) Genética Molecular e Metabolismo. 82(1):1-3. DOI: 10.1016/j.ymgme.2004.02.003

2003

McCulloch, V., Shadel, GS O fator de transcrição mitocondrial humano B1 interage com a região de ativação C-terminal do h-mtTFA e estimula a transcrição independentemente de sua atividade de RNA metiltransferase. (2003) Biologia Molecular e Celular. 23 (16): 5816-24.

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Rodeheffer, MS, Shadel, GS Múltiplas interações envolvendo o domínio amino-terminal da mtRNA polimerase de levedura determinam a eficiência da síntese de proteínas mitocondriais. (2003) Jornal de Química Biológica. 278(20):18695-701. DOI: 10.1074/jbc.M301399200

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Seidel-Rogol, BL, McCulloch, V., Shadel, GS O fator de transcrição mitocondrial humano B1 metila o RNA ribossômico em uma haste-alça conservada. (2003) Genética da Natureza. 33(1):23-4. DOI: 10.1038/ng1064

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2002

Coelho, PS, Bryan, AC, Kumar, A., Shadel, GS, Snyder, M. Uma nova proteína mitocondrial, Tar1p, é codificada na cadeia antisense do rDNA 25S nuclear. (2002) Genes e desenvolvimento. 16(21):2755-60. DOI: 10.1101/gad.1035002

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O'Rourke, TW, Doudican, NA, Mackereth, MD, Doetsch, PW, Shadel, GS A disfunção mitocondrial devido ao dano oxidativo do DNA mitocondrial é reduzida por meio de ações cooperativas de diversas proteínas. (2002) Biologia Molecular e Celular. 22 (12): 4086-93.

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O genoma mitocondrial é um alvo significativo de agentes genotóxicos exógenos e endógenos; no entanto, os determinantes que governam essa suscetibilidade e as vias disponíveis para resistir ao dano do DNA mitocondrial (mtDNA) não estão bem caracterizados. Aqui, relatamos que o dano oxidativo do mtDNA é elevado em cepas sem Ntg1p, fornecendo a primeira evidência funcional direta de que essa enzima de reparo por excisão de base localizada na mitocôndria funciona para proteger o mtDNA. No entanto, as cepas nulas de ntg1 não exibiram um fenótipo deficiente em respiração mitocondrial (pequeno), sugerindo que o dano do mtDNA é negociado pelas ações cooperativas de múltiplas vias de resistência ao dano. Mutações nulas em ABF2 ou PIF1, dois genes implicados na manutenção e recombinação do mtDNA, exibem um fenótipo sintético-pequeno em combinação com mutações nulas em ntg1 que são acompanhadas por mutagênese pontual aprimorada do mtDNA nas cepas de duplo mutante correspondentes. Este fenótipo foi parcialmente resgatado pelo ácido malônico, indicando que as espécies reativas de oxigênio geradas pela cadeia de transporte de elétrons contribuem para a disfunção mitocondrial em cepas abf2 Delta. Em contraste, quando dois outros genes envolvidos na recombinação do mtDNA, CCE1 e NUC1, foram inativados, um forte fenótipo sintético-pequeno não foi observado, sugerindo que os efeitos mediados por Abf2p e Pif1p são devidos a novas atividades dessas proteínas além da recombinação. Esses resultados documentam a existência de mecanismos independentes de recombinação, além do reparo por excisão de base para lidar com o dano oxidativo do mtDNA em Saccharomyces cerevisiae. Esses sistemas provavelmente são relevantes para aqueles que operam em células humanas onde a recombinação do mtDNA é menos prevalente, validando a levedura como um sistema modelo para estudar essas questões importantes.

Seidel-Rogol, BL, Shadel, GS Modulação da transcrição mitocondrial em resposta à depleção e reposição de mtDNA em células HeLa. (2002) Pesquisa de Ácidos Nucleicos. 30 (9): 1929-34.

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McCulloch, V., Seidel-Rogol, BL, Shadel, GS Um fator de transcrição mitocondrial humano está relacionado com RNA adenina metiltransferases e se liga a S-adenosilmetionina. (2002) Biologia Molecular e Celular. 22 (4): 1116-25.

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Bryan, AC, Rodeheffer, MS, Wearn, CM, Shadel, GS Sls1p é um regulador ligado à membrana de processos acoplados à transcrição envolvidos na expressão gênica mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae. (2002) Genética. 160 (1): 75-82.

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2001

Shadel, GS, Seidel-Rogol, BL Ensaios diagnósticos para defeitos na replicação e transcrição do mtDNA em leveduras e humanos. (2001) Métodos em Biologia Celular. 80:465-79. DOI: 10.1016/S0091-679X(06)80023-3

Seidel-Rogol, BL, Shadel, GS Ensaios diagnósticos para defeitos na replicação e transcrição do DNA mitocondrial em leveduras e células humanas. (2001) Métodos em Biologia Celular. 65:413-27. DOI: 10.1016/s0091-679x(01)65024-6

Rodeheffer, MS, Boone, BE, Bryan, AC, Shadel, GS A Nam1p, uma proteína envolvida no processamento e tradução do RNA, é acoplada à transcrição através de uma interação com a RNA polimerase mitocondrial de levedura. (2001) Jornal de Química Biológica. 276(11):8616-22. DOI: 10.1074/jbc.M009901200

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2000

Devine, JH, Shadel, GS Ensaio de atividade autoindutora com cepas de sensor de Escherichia coli luminescentes abrigando um regulon modificado de Vibrio fischeri lux. (2000) Metanfetamina Enzimol. 305:279-87. DOI: 10.1016/s0076-6879(00)05494-x

Shadel, GS, Buckenmeyer, GA, Clayton, DA, Schmitt, ME A análise mutacional do componente de RNA de Saccharomyces cerevisiae RNase MRP revela fenótipos nucleares distintos. (2000) Gene. 245(1):175-84. DOI: 10.1016/s0378-1119(00)00013-5

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1999

Shadel, GS Levedura como modelo para replicação do mtDNA humano. (1999) Jornal Americano de Genética Humana. 65(5):1230-7. DOI: 10.1086/302630

Wang, Y., Shadel, GS A estabilidade do genoma mitocondrial requer um domínio amino-terminal da polimerase de RNA mitocondrial de levedura. (1999) Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 96(14):8046-51. DOI: 10.1073/pnas.96.14.8046

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1997

Shadel, GS, Clayton, DA Manutenção do DNA mitocondrial em vertebrados. (1997) Revisão Anual de Bioquímica. 66:409-35. DOI: 10.1146/annurev.biochem.66.1.409

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1996

Sitnikov, DM, Shadel, GS, Baldwin, TO Mutantes independentes de autoindutor do ativador transcricional LuxR exibem efeitos diferenciais nos dois promotores lux de Vibrio fischeri. (1996) Genética Molecular e Geral. 252(5):622-5. DOI: 10.1007/bf02172408

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Shadel, GS, Clayton, DA Isolamento e caracterização de homólogos do fator A de transcrição mitocondrial de vertebrados. (1996) Metanfetamina Enzimol. 264:149-58. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64016-6

Shadel, GS, Clayton, DA Mapeamento de promotores na região de loop de deslocamento do DNA mitocondrial de vertebrados. (1996) Metanfetamina Enzimol. 264:139-48. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64015-4

Carrodeguas, JA, Yun, S., Shadel, GS, Clayton, DA, Bogenhagen, DF Conservação funcional do mtTFB de levedura, apesar da extensa divergência de sequência. (1996) Expr. Gen. 6 (4): 219-30.

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1995

Dairaghi, DJ, Shadel, GS, Clayton, DA O fator A de transcrição mitocondrial humana e a integridade do espaçamento do promotor são necessários para o início da transcrição. (1995) Biochimica et Biophysica Acta. 1271(1):127-34. DOI: 10.1016/0925-4439(95)00019-z

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Dairaghi, DJ, Shadel, GS, Clayton, DA A adição de uma cauda carboxil-terminal de 29 resíduos converte uma simples proteína contendo caixa HMG em um ativador transcricional. (1995) Jornal de Biologia Molecular. 249(1):11-28. DOI: 10.1006/jmbi.1995.9889

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Shadel, GS, Clayton, DA Um fator de transcrição mitocondrial Saccharomyces cerevisiae, sc-mtTFB, compartilha características com fatores sigma, mas é funcionalmente distinto. (1995) Biologia Molecular e Celular. 15(4):2101-8. DOI: 10.1128/mcb.15.4.2101

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1993

Shadel, GS, Clayton, DA Iniciação da transcrição mitocondrial. Variação e conservação. (1993) Jornal de Química Biológica. 268 (22): 16083-6.

1992

Shadel, GS, Baldwin, TO Autorregulação positiva do gene Vibrio fischeri luxR. LuxR e autoindutor ativam a transcrição de luxR independente e dependente do complexo proteico ativador de gene catabólito cAMP. (1992) Jornal de Química Biológica. 267 (11): 7696-702.

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Shadel, GS, Baldwin, TO Identificação de um elemento regulador localizado distante no gene luxD necessário para autorregulação negativa do gene Vibrio fischeri luxR. (1992) Jornal de Química Biológica. 267 (11): 7690-5.

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1991

Shadel, GS, Baldwin, TO A proteína Vibrio fischeri LuxR é capaz de estimulação bidirecional da transcrição e regulação positiva e negativa do gene luxR. (1991) J. Bacteriol. 173(2):568-74. DOI: 10.1128/jb.173.2.568-574.1991

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A regulação dos genes necessários para a bioluminescência na bactéria marinha Vibrio fischeri (o lux regulon) é um processo complexo que requer a coordenação de vários sistemas. O nível primário de regulação é mediado por uma proteína reguladora positiva, LuxR, e uma pequena molécula difusível, N-(3-oxo-hexanoil)-homoserina lactona, denominada autoindutora. A transcrição do gene luxR, que codifica a proteína reguladora, é regulada positivamente pelo sistema AMP-CAP cíclico. O lux regulon de V. fischeri consiste em dois operons transcritos divergentemente designados operonL e operonR. A transcrição do operon direito (operonR; luxICDABE), que consiste nos genes necessários para a síntese de autoindutores (luxI) e produção de luz (luxCDABE), é ativada por LuxR de forma autoindutora-dependente. O operon esquerdo (operonL) consiste em um único gene conhecido, luxR. A proteína LuxR também demonstrou diminuir a transcrição do operonL por meio de um mecanismo dependente de autoindutor, regulando assim negativamente sua própria síntese. Neste artigo, demonstramos que a repressão dependente de autoindutor da transcrição do operonL requer não apenas LuxR, mas também sequências de DNA dentro do operonR que ocorrem a montante do promotor do operonL. Na ausência dessas sequências de DNA, a proteína LuxR causa uma ativação autoindutora dependente da transcrição do operonL. O operador lux, localizado na região de controle entre os dois operons, foi necessário para ambas as respostas dependentes de autoindutor positivo e negativo. Pela titulação de altos níveis de LuxR fornecidos em trans com autoindutor sintético, descobrimos que baixos níveis de autoindutor podem provocar uma resposta positiva mesmo na presença de sequências de DNA de ação negativa, enquanto níveis mais altos de autoindutor resultaram em uma resposta negativa. Sem essas sequências de DNA em operonR, LuxR e transcrição estimulada por autoindutor, independentemente do nível de autoindutor. Esses resultados sugerem que uma mudança entre estimulação e repressão da transcrição do operon L é mediada pelos níveis do complexo LuxR-autoindutor, que nesses experimentos reflete o nível de autoindutor no meio de crescimento.

1990

Shadel, GS, Young, R., Baldwin, TO Uso de lise celular regulada em uma seleção genética letal em Escherichia coli: identificação da região de ligação autoindutora da proteína LuxR de Vibrio fischeri ATCC 7744. (1990) J. Bacteriol. 172(7):3980-7. DOI: 10.1128/jb.172.7.3980-3987.1990

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Shadel, GS, Devine, JH, Baldwin, TO Controle do lux regulon de Vibrio fischeri. (1990) J. Biolumin. Quimilumin. 5(2):99-106. DOI: 10.1002/bio.1170050205

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1989

Devine, JH, Shadel, GS, Baldwin, TO Identificação do operador do regulon lux da cepa Vibrio fischeri ATCC7744. (1989) Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 86(15):5688-92. DOI: 10.1073/pnas.86.15.5688

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Escherichia coli que carregam um plasmídeo recombinante contendo o Vibrio fischeri lux regulon expressam luminescência que imita a luminescência de V. fischeri. O regulon lux consiste em dois operons transcritos divergentemente, o operon à direita (genes luxICDABE) e o operon à esquerda (gene luxR). Os genes luxR e luxI e a região de controle que separa os dois operons fornecem o controle regulatório primário sobre o regulon lux; os mecanismos reguladores resultam em um aumento dramático na taxa de síntese de luciferase após a indução, aparentemente devido a um mecanismo único de feedback positivo autorregulatório, e em uma enorme diferença (maior que 10(4) nos níveis de luminescência nas células antes e depois da indução. O modelo geralmente aceito de regulação primária da bioluminescência em V. fischeri envolve a interação do produto do gene luxR e N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona, o autoindutor produzido pela enzima codificada por luxI, o primeiro gene do gene da direita operon, com uma sequência de operador dentro da região de controle para estimular a transcrição do operon à direita em um loop de feedback positivo. Usamos o mapeamento de deleção de um vetor repórter de transcrição para determinar a localização aproximada do operador. Por mutagênese direcionada ao local do presumido operador, demonstramos que a repetição invertida de 20 pares de bases ACCTGTAGGA/TCGTA CAGGT (onde a linha vertical é o centro de simetria), que possui notável semelhança com a sequência de reconhecimento da proteína pleiotrópica repressora LexA, é o operador do lux regulon. Também descobrimos que a deleção de sequências a montante do palíndromo leva ao aumento da transcrição do promotor direito (PR), indicativo de um elemento de ação cis que reprime a transcrição na ausência do complexo autoindutor LuxR. As modificações do palíndromo que eliminam a estimulação pelo autoindutor LuxR da transcrição do PR não têm efeito na repressão pelo(s) mecanismo(s) de ação cis, sugerindo que o palíndromo não é necessário para a repressão do operon direito. Assim, parece que o grande aumento na transcrição após a indução do lux regulon é o resultado de pelo menos dois mecanismos independentes, um positivo e outro negativo.

Baldwin, TO, Devine, JH, Heckel, RC, Lin, JW, Shadel, GS A sequência completa de nucleotídeos do lux regulon de Vibrio fischeri e da região luxABN de Photobacterium leiognathi e o mecanismo de controle da bioluminescência bacteriana. (1989) J. Biolumin. Quimilumin. 4(1):326-41. DOI: 10.1002/bio.1170040145

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Determinamos a sequência completa de nucleotídeos de um fragmento de DNA de 7622 pares de bases da cepa ATCC7744 de Vibrio fischeri que contém todas as informações necessárias para conferir bioluminescência regulada transmitida por plasmídeo a cepas de Escherichia coli. O lux regulon de V. fischeri consiste em dois operons transcritos de forma divergente, L (esquerda) e R (direita), e pelo menos sete genes, luxR (L operon) e luxICDABE (R operon) e a região de controle interveniente. Os genes luxA e luxB codificam respectivamente as subunidades alfa e beta da luciferase. A ordem do gene luxCDABE observada em V. fischeri é a mesma de V. harveyi. Nós determinamos a sequência do luxAB e regiões flanqueadoras de Photobacterium leiognathi e encontramos sequências a montante homólogas com luxC da espécie Vibrio, mas entre luxB e luxE, há um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína de 227 aminoácidos (26,229 peso molecular ) que não é encontrado neste local nas espécies de Vibrio. A sequência de aminoácidos do terminal amino da proteína codificada é quase idêntica à determinada por O'Kane e Lee (Universidade da Geórgia) para a flavoproteína não fluorescente de uma espécie de Photobacterium intimamente relacionada (Dr. Dennis O'Kane, comunicação pessoal). Portanto, designamos esse gene luxN. Existe uma repetição invertida de 20 bases ACCTGTAGGAxTCGTACAGGT, centrada entre as bases 927 e 928 na região entre os dois operons de V. fischeri. Esta região parece cumprir duas funções: é crítica para a proteína LuxR exercer seu efeito e é um sítio de ligação de consenso para a proteína LexA de E. coli, uma proteína reguladora negativa envolvida com a resposta SOS. Existem sequências dentro da região de codificação luxR que parecem funcionar de maneira cis-agindo para reprimir a transcrição dos promotores esquerdo e direito na ausência das respectivas proteínas ativadoras da transcrição, resultando assim em baixos níveis basais de transcrição. Agora parece claro que existem vários níveis de controle no sistema lux, permitindo uma modulação da intensidade da bioluminescência de mais de quatro ordens de magnitude.

Gerald Shadel, PhD

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