Der BPHO Core bietet Schulungen und Ausrüstung für Licht- und Elektronenmikroskopie, Probenverarbeitung, Bildgebung und Analyse. Neben der Direktorin, Dr. Daniela Boassa, beschäftigt das BPHO zwei Vollzeit-Bildgebungsspezialisten, Dr. Elsie Quansah und Mr. Sammy Weiser Novak, die über Fachwissen in Licht- und Elektronenmikroskopie sowie Datenanalyse verfügen.
Schulungsmaterialien, Protokolle und Handbücher
Anzeigen / Instrumente
Die Biophotonics Center Core Facility soll der Salk-Fakultät technische Unterstützung und logistischen Zugang zu modernsten Bildgebungstechnologien bieten, um die nächste Generation biologischer Durchbrüche am Institut zu ermöglichen.
Verfügbare Ausrüstung für den Kerngebrauch:
Lichtmikroskope
- Zeiss LSM 880 mit Airyscan
- Es gibt drei LSM 880 mit Airyscan im Kern (bezeichnet als 880-1, 880-2, 880-3). Sie sind mit den folgenden Laserlinien ausgestattet: 405, 458, 488, 514, 561, 594 und 633 nm. Sie verfügen über einen flüssigkeitsgekühlten internen GAsP-Detektor mit 34 Elementen für die einzelmolekülempfindliche Vollspektralbildgebung über das sichtbare Spektrum und einen Durchlichtdetektor für die DIC-Bildgebung. Diese Mikroskope verfügen über das Airyscan FAST-Modul für eine schnelle, verbesserte Auflösung (~1.7x höher als bei herkömmlichen konfokalen Mikroskopen). Motorisierter X-, Y-Tisch und Z-Galvo-Fokustisch. Die Erfassungssoftware ist Zen Black (Zen 2.3).
880-1 (invertiert) -
Objektive: 10x/0.45, 20x/0.8, 40x/1.0 W, 40x/1.0 Öl, 63x/1.4 Öl –
Ausgestattet mit einem Definite Focus-Modul und Inkubation für erweiterte Zeitrafferaufnahmen lebender Zellen. Inkubationskammer ermöglicht Regulierung von Temperatur und CO2.
880-2 (invertiert)-
Objektive: 10x/0.3, 20x/0.8, 40x/1.0 W, 63x/1.4 Öl, 63x/1.46 Öl –
Ausgestattet mit einem Definite Focus-Modul und Inkubation für erweiterte Zeitrafferaufnahmen lebender Zellen. Inkubationskammer ermöglicht Regulierung von Temperatur und CO2.
880-3 (stehend) -
Objektive: 10x/0.45, 20x/0.8, 20x/1.0 W, 63x/1.4 Öl – Nicht für die Lebendzellbildgebung eingerichtet.
- Konfokales Mikroskop Zeiss LSM 710
- Dieses inverse Mikroskop ist mit den folgenden Laserlinien ausgestattet: 405, 458, 488, 514, 561, 594 und 633 nm. Es ist außerdem mit einem internen Detektor mit 34 Elementen für die vollständige Spektralbildgebung über das sichtbare Spektrum und einem Durchlichtdetektor für die DIC-Bildgebung ausgestattet. Ausgestattet mit einem Definite Focus-Modul. Die Erfassungssoftware ist Zen Black (ZEN 2.3).
Objektive: 10x/0.45, 20x/0.8, 20x/1.0 W, 63x/1.4 Öl
- Konfokales Spinning-Disk-Mikroskop von Zeiss
- Dieses inverse Mikroskop ist mit den folgenden Laserlinien ausgestattet: 405, 488, 561 und 635 nm, sowie einem Yokogawa-Spinning-Disk-Scankopf mit einer EM-CCD-Kamera und einem Stage-Top-Inkubationssystem für die Hochgeschwindigkeits-Konfokalbildgebung lebender Zellen in Kultur. Die Erfassungssoftware ist Zen Blue (ZEN 2.3).
Objektive: 5x/0.25, 10x/0.45, 20x/0.8, 40x/1.3 Öl, 63x/1.4 Öl, 100x/1.4 Öl
- Konfokales Mikroskop Olympus FluoView FV3000
- Invertiertes Mikroskop mit Laserlinien: 405, 445, 488, 514, 561, 594, 640, 730 nm. Die Wellenlängenerkennungsfunktionen bis zum NIR-Bereich von bis zu 890 nm durch eine Reihe sorgfältig entwickelter NIR-, NIR-empfindlicher GaAs-Detektoren ermöglichen bis zu 6 Kanäle für Multiplex-Bildgebung von Violett bis NIR (400 nm – 890 nm), Resonanzscanner für Zeitraffer-Bildgebung. Silikonobjektive mit großem Arbeitsabstand ermöglichen detaillierte mikroskopische Bildgebung in der Tiefe. Ausgestattet mit einer Tokai Hit-Inkubationskammer zur Aufrechterhaltung optimaler Temperatur, CO2 und Luftfeuchtigkeit für die Bildgebung lebender Zellen. TruFocus Z-Drift-Kompensationssystem, das den Fokus während der Bildgebung lebender Zellen trotz Temperaturänderungen oder hinzugefügter Reagenzien beibehält. Die Erfassungssoftware ist FV31S-SW.
Objektive: 4x/0.16, 20x/0.8, 30x/1.05 Sil, 40x/1.25 Sil, 60x/1.5 Öl, 100x/1.35 Sil.
- Dieses Mikroskop ist mit 405, 445, 488, 515, 561 und 638 nm Laserlinien ausgestattet. Es ist ideal für die Bildgebung großer 3D- oder 4D-Volumina. Es ist ein eigenständiges, versiegeltes Boxsystem mit Temperatur- und CO2-Kontrolle. Es verfügt außerdem über zwei PCO.Edge sCMOS-Kameras. Die Erfassungssoftware ist Zen Black (ZEN 2014 SP1).
Beleuchtungsobjektive: zwei 5x/0.1 und zwei 10x/0.2
Detektionsobjektive: 5x/0.16, 10x/0.5 und 20x/1.0 sowohl für CLARITY als auch für Wasserimmersion.
- Olympus VS-120 Virtuelles Objektträger-Scanning-Mikroskop
- Dieser virtuelle Objektträgerscanner ist mit einem automatischen 100-Objektträger-Lader und mehreren Bildgebungsmodalitäten ausgestattet. Zu den fluoreszierenden Filterwürfeln gehören: DAPI, FITC, TRITC und CY5. Das System nutzt außerdem ein zusätzliches Emissionsfilterrad, das die Verwendung eines Quadband-Exciters ermöglicht. Darüber hinaus kann dieses System mit Brightfield (Histologie) Bilder erstellen. Die Erfassungssoftware ist VS-ASW.
Objektive: 2x/0.08, 4x/0.16, 10x/0.4, 20x/0.75 und 40x/0.95.
- Zeiss Axioscan 7 Slide Scanner-Mikroskop (im Folgenden Newton genannt)
- Automatisches Scannen von bis zu 100 Objektträgern in einem Durchgang. Sowohl Fluoreszenz- als auch Hellfeldbildgebung möglich. Dieses System ist mit einer Colibri 7 LED-Lichtquelle mit Anregung bei 385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm ausgestattet. Hellfeldbildgebung mit der Farbkamera Axiocam 705 und Fluoreszenzbildgebung mit der Kamera Axiocam 712. Es verfügt über ein Filterrad mit 10 Positionen, bestehend aus Einzelband-Filtersätzen für spezifische Bildgebung: FS96 für DAPI, FS38 für AF488, FS43 für AF555, FS64 für AF594, FS50 für AF647 und Mehrband-Filtersätzen für schnelle Bildgebung: FS90- DAPI, AF488, AF555, AF647 und FS110- DAPI, AF488, AF594, AF750. Die Erfassungssoftware ist Zen Blue (ZEN 3.9).
Objektive: 5x/0.25, 10x/0.45, 20x/0.5, 20x/0.8, 40x/0.95.
- Zeiss Axioscan 7 Slide Scanner-Mikroskop (Einstein genannt)
- Automatisches Scannen von bis zu 100 Objektträgern in einem Durchgang. Sowohl Fluoreszenz- als auch Hellfeldabbildung möglich. Dieses System ist mit einer Colibri 7 LED-Lichtquelle mit Anregung bei 385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm ausgestattet. Hellfeldabbildung mit Axiocam 705-Farbkamera und Fluoreszenzabbildung mit Orca Flash-Kamera. Es verfügt über ein Filterrad mit 6 Positionen, bestehend aus einem Einzelbandfiltersatz für spezifische Abbildungen: FS90 für AF488, AF555, AF647, FS64 für AF594 und Mehrbandfiltersätzen für schnelle Abbildungen: FS110 für schnelle Abbildungen von DAPI, AF488, AF594, AF750. Die Erfassungssoftware ist Zen Blue (ZEN 3.10).
Objektive: 5x/0.25, 10x/0.45, 20x/0.8, 40x/0.9
- Zeiss Elyra PS.1 Super Resolution Mikroskop
- Dieses invertierte Mikroskop ist mit den folgenden Laserlinien ausgestattet: 405, 488, 561 und 635 nm und vier Farbfiltersätzen für die Bildgebung in PAL-M und SR-SIM mit Superauflösung. Es ist mit zwei EM-CCD-Kameras ausgestattet, einer Andor iXon3 897 512×512 35fps-Kamera für die PAL-M-Bildgebung im TIRF-Modus und einer Andor iXon3 888 1024×1024 9fps-Kamera für 3D SR-SIM. Das Mikroskop verfügt außerdem über eine dedizierte Offline-Verarbeitungs-Workstation für die Rekonstruktion von Bilddatensätzen in Superauflösung. Die Erfassungssoftware ist Zen Black (Zen 2.3 SP1).
Objektive: 10x/0.3, 63x/1.4, 100x/1.46, 100x/1.57
- Oxford Nanoimager (ONI)
- Dieses invertierte Mikroskop ist für TIRF, Epifluoreszenz, HILO-Beleuchtung und PALM/STORM-Superauflösungsbildgebung konfiguriert. Es ist mit den folgenden Laserlinien ausgestattet: 405 nm, 488, 561 und 640. Zwei gleichzeitige Bildgebungsbänder und Laserfiltersätze. TIRF-Autoausrichtung, Autofokus und Drift-/Vibrationskompensation sind alle integriert. Die Software umfasst smFRET-Analyse, Einzelpartikelverfolgung, Echtzeitlokalisierung, Laserprogrammierung, Python-Skriptschnittstelle und Kolokalisierungsanalyse.
Objektiv: 100x/1.45
- Zeiss PALM Microbeam V4 Capture Mikrodissektionssystem
- Dieses Mikrodissektionsmikroskop nutzt spezielle Membranobjektträger, um mikroskopische Gewebeschnitte oder einzelne Zellen zu schneiden und in Klebekappen von Eppendorf-Röhrchen zu sammeln. Weitere Analysen der ausgewählten Unterbereiche oder isolierten Zellen können für DNA-, RNA- und Proteinanalysen durchgeführt werden. Die Erfassungssoftware ist PALMRobo V4.5
Objektive: 5x/0.25, 10x/0.5, 40x/0.6
Elektronenmikroskope
- Energiegefiltertes Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Carl Zeiss Libra 120 kV PLUS, ausgestattet mit einer 2k x 2k faseroptisch gekoppelten YAG-CCD-Kamera, die hochempfindliche Montagebilder ermöglicht, und einem Energiefilter in der Säule, der kontrastreiche Bilder liefert, das Signal-Rausch-Verhältnis in Bildern verbessert, sowie Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS), die die Elementanalyse von Proben ermöglicht. Darüber hinaus ist das TEM auch mit einem neigbaren Probenhalter (+/- 75 Grad) für tomografische Bilder, einem Energiefilter in der Säule für Elektronenverlust und kontrastreiche Bilder biologischer Proben und einem kryogen gekühlten Objekttisch für die native Bildgebung von Proteinen und gefrorenen, hydratisierten Schnitten ausgestattet. Der Objekttisch ist auch für einachsiges Neigen zur Durchführung von Kryo-Tomografien ausgelegt.
- Carl Zeiss SIGMA Rasterelektronenmikroskop mit variablem Druck und Feldemissionskanone, ausgestattet mit Sekundärelektronen- (SE), Rückstreuelektronen- (BSE) und Detektoren für variablen Druck (VPSE), STEM-Detektor und Kalttisch. Das System ist außerdem mit Hardware/Software für das ATLAS-Montagebildmodul und das Shuttle and Find-Navigationsmodul für korrelative Mikroskopie ausgestattet, um große gekachelte Bilder und einen Hochdurchsatz-Workflow zu erzeugen.
- Das Gatan 3View ist ein vollautomatisches Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBFSEM)-System. In der Vakuumkammer des SIGMA SEM ist ein Ultramikrotom montiert. Das 3View seziert und bildet die freigelegte Blockfläche automatisch ab. Die generierten Datensätze können kombiniert werden, um Z-Stapel eines Volumens zu erstellen und später segmentiert zu werden.
Geräte und Dienstleistungen für die Probenvorbereitung
Der BPHO-Kern verfügt über einen eigenen Probenvorbereitungsraum innerhalb der Anlage, einschließlich der Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie. Die Instrumente zur Probenvorbereitung umfassen:
- Pelco BioWave Pro Mikrowelle
- Leica UC7/FC7 Ultramikrotom
- Leica Vibratom
- Leica Kryostat
- Leica EM ICE Hochdruckgefriergerät
- Leica AFS Automatischer Freeze-Ersatz
- Leica EM CPD300 Automatisierter Trockner für kritische Punkte
- Leica EM SCD500 Sputter Coater/Verdampfer
- Leica EM GP Automatischer Tauchgefrierschrank
- Vitrobot-System
- Clipstation
- Solarus II Plasmareiniger
- Logos X-CLARITY
Für weitere Informationen fordern Sie bitte an: bpho@salk.edu.
Der BPHO-Kern ermöglicht die Verarbeitung von Proben durch fachmännisch geschultes Personal unter Verwendung etablierter Protokolle, die im Folgenden beschrieben werden:
- Morphologie – Proben werden für konventionelle oder Kryo-TEM oder SEM verarbeitet. Die erzeugten Bilder liefern entweder ultrastrukturelle (TEM) oder topografische (SEM) Informationen.
- Immunhistochemie – Die standardmäßige Immunmarkierung vor und nach dem Einbetten wird an Monoschichten oder Gewebeproben durchgeführt. Beide Methoden ermöglichen eine subzelluläre Lokalisierung von Antigenen.
- Volumetrisch – Dreidimensionale Datensätze können entweder mittels Elektronentomographie, Kryo-Elektronentomographie, Serial Block Face SEM (SBFSEM) oder Array-Tomographie gewonnen werden. Dies ist ideal, um Beziehungen aufzudecken, die in einem einzelnen Abschnitt nicht vollständig offenbart werden.
- Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie – CLEM bietet Zugang zu Antigenen und die Visualisierung ganzer Zellen, lebend oder fixiert, um dynamische Prozesse, Proteinlokalisierung und Zellstruktur, die durch EM aufgedeckt werden, weiter aufzuklären und so eine Brücke zwischen den beiden Methoden zu schlagen.
- Hochdruckgefrieren – Durch Kryo-Hochdruckgefrieren werden Proben für die ultimative Kombination aus konservierter Ultrastruktur und verbessertem Zugang zu Antigenen immobilisiert.
- Expansionsmikroskopie – Erweiterung der Proben für die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung unter Verwendung etablierter Protokolle und Reagenzien aus dem Boyden-Labor (MIT) und ExT Inc. (Cambridge).
- Gewebereinigung – X-CLARITY-Elektrophorese-basierte Gewebereinigung, optimiert für unsere CLARITY-Optik.
Datenanalyse und -speicherung
- Ein Speicherserver für die kurz- und langfristige Datenspeicherung.
- Ein Computercluster zur Analyse und Rekonstruktion der nanoskaligen Architektur in drei Dimensionen.
- Drei Dual-Quad-Prozessor-Workstations mit den Bildanalyse-Softwarepaketen MATLAB, Metamorph, Imaris, Amira, Icarus und ImageJ/Fiji sowie den Softwarepaketen Microsoft Office Suite und Adobe Creative Suite. Diese Arbeitsplätze sind außerdem mit Mikroskopsoftware von Zeiss (ZEN Black 2012), Olympus und Nikon ausgestattet.
- Eine High-End-Workstation, ausgestattet mit der oben aufgeführten Software und dem Zeiss Elyra Super-Resolution-Bildverarbeitungspaket.
- Eine zweite High-End-Workstation, ausgestattet mit MATLAB, Imaris, ImageJ/Fiji und dem Bildverarbeitungspaket Gatan Digital Micrograph Suite.
Links zu Mikroskopie-Informationen:
- Carl Zeiss Online-Mikroskopie-Campus
- http://www.zeiss.com/campus
- Nikon-Mikroskopie
- http://www.microscopyu.com/
- Microlist – Eine Ressource für Lichtmikroskopiker
- https://www.microlist.org/
