Neue Technologien ermöglichen bessere Details als je zuvor zu gentechnisch veränderten Pflanzen

Neue Technologien ermöglichen bessere Details als je zuvor zu gentechnisch veränderten Pflanzen

Salk-Forscher nutzten die neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien, um genau zu untersuchen, was auf molekularer Ebene passiert, wenn sie neue Gene in Pflanzen einbauen

LA JOLLA – Salk-Forscher haben die Genome und Epigenome gentechnisch veränderter Pflanzenlinien mit der höchsten Auflösung aller Zeiten kartiert, um genau zu enthüllen, was auf molekularer Ebene passiert, wenn ein Stück fremder DNA eingefügt wird. Ihre Ergebnisse, veröffentlicht in der Zeitschrift PLoS Genetics am 18. Januar 2019 erläutern die routinemäßigen Methoden zur Modifikation von Pflanzen und bieten neue Wege, um potenzielle Off-Target-Effekte effektiver zu minimieren.

„Dies war wirklich ein Ausgangspunkt, um zu zeigen, dass es möglich ist, die neuesten Kartierungs- und Sequenzierungstechnologien zu verwenden, um die Auswirkungen des Einfügens von Genen in das Pflanzengenom zu untersuchen“, sagt Howard Hughes Medical Institute Investigator Josef Ecker, Professor am Labor für Pflanzenmolekular- und Zellbiologie von Salk und Leiter des Labors für Genomanalyse.

Wenn ein Wissenschaftler ein neues Gen in eine Pflanze einbauen möchte – für Grundlagenforschungszwecke oder um die Gesundheit oder Ernährung einer Nahrungspflanze zu verbessern – verlässt er sich normalerweise darauf Agrobacterium tumefaciens um den Job zu erledigen. Agrobacterium ist das Bakterium, das Wurzelhalsgallentumoren verursacht, große Ausbuchtungen an Baumstämmen. Vor Jahrzehnten entdeckten Wissenschaftler, dass das Bakterium, wenn es einen Baum infizierte, einen Teil seiner DNA auf das Genom des Baumes übertrug. Seitdem haben sich Forscher diese Transferfähigkeit zunutze gemacht Agrobacterium für ihre eigenen Zwecke, indem sie ihre Transfer-DNA (T-DNA) verwenden, um ein gewünschtes Gen in eine Pflanze zu übertragen.

Kürzlich hatten DNA-Sequenzierungstechnologien begonnen, dies anzudeuten, als die Agrobacterium T-DNA wird verwendet, um neue Gene in eine Pflanze einzufügen. Dies kann zu zusätzlichen Veränderungen der strukturellen und chemischen Eigenschaften der nativen DNA führen.

„Biotech-Unternehmen investieren viel Zeit und Mühe in die Charakterisierung transgener Pflanzen und ignorieren Kandidaten mit unerwünschten Veränderungen, ohne – aus grundlegender biologischer Sicht – zu verstehen, warum diese Veränderungen aufgetreten sein könnten“, sagt Ecker. „Unser neuer Ansatz bietet eine Möglichkeit, diese Effekte besser zu verstehen und kann dazu beitragen, den Prozess zu beschleunigen.“

„Die größte Unbekannte war, ob und wie viele Kopien der T-DNA gleichzeitig mit dem gewünschten Stück eingefügt wurden“, sagt Florian Jupe, ein ehemaliger Salk-Forschungsmitarbeiter, der jetzt bei Bayer Crop Science arbeitet. Jupe, Salk-Mitarbeiter Mark Zander und Forschungsassistentin Angeline Rivkin sind zusammen mit Todd Michael des J. Craig Venter Institute.

Da der T-DNA-Ansatz zur Integration vieler Kopien eines gewünschten Gens in eine Pflanze führen kann, kann es schwierig sein, das Endergebnis mit der Standard-DNA-Sequenzierung zu untersuchen, da die meisten Technologien Schwierigkeiten haben, sich stark wiederholende DNA-Abschnitte zu sequenzieren. Aber Ecker und seine Kollegen wandten sich einer neuen Kombination von Ansätzen zu – einschließlich optischer Kartierung und Nanoporensequenzierung –, um diese langen Abschnitte in hoher Auflösung zu betrachten. Sie wandten die Technologien auf vier zufällig ausgewählte T-DNA-Linien an Arabidopsis thaliana, eine häufig verwendete Modellpflanze in der Biologie. (Diese Pflanzen stammen aus einer großen Population von T-DNA-Insertionsmutanten, die mithilfe eines erzeugt wurden Arabidopsis Transformationsmethode, genannt „Floral Dip“, zur Untersuchung der Genfunktion.)

Die optische Kartierung ergab, dass die Pflanzen zwischen einer und sieben verschiedene Insertionen oder Umlagerungen in ihren Genomen aufwiesen, deren Größe sich um fast das Zehnfache bewegte. Die Nanoporensequenzierung und die Rekonstruktion der Genome zweier Linien bestätigten die Insertionen mit Einzelbuchstabenauflösung, einschließlich ganzer DNA-Segmente, die zwischen Chromosomen in einer der ausgewählten Linien ausgetauscht oder transloziert wurden. Geninsertionen selbst zeigten eine Vielzahl von Mustern, wobei das eingefügte DNA-Fragment manchmal durcheinander, invertiert oder sogar zum Schweigen gebracht wurde.

„Diese Studie war noch vor einem Jahr nicht möglich“, sagt Michael. „Die Nanoporensequenzierung, die von manchen als ‚heiliger Gral‘ der DNA-Sequenzierung bezeichnet wird, hat das Lesen selbst der komplexesten Regionen des Genoms revolutioniert, die bisher völlig unzugänglich und unbekannt waren.“

Als die Forscher schließlich Pakete genetischen Materials, sogenannte Histone, untersuchten, fanden sie weitere Veränderungen. Histonproteine ​​verpacken DNA in Struktureinheiten, und Modifikationen dieser Histone bestimmen, ob ein Gen für die Nutzung durch eine Zelle zugänglich ist (eine Regulierungsebene, die als Epigenetik bezeichnet wird). Je nachdem, wo die T-DNA integriert wurde, erschienen oder verschwanden bestimmte Modifikationen des nahegelegenen Histons und veränderten möglicherweise die Regulation oder Aktivierung anderer nahegelegener Gene.

„Jetzt haben wir die ersten hochauflösenden Erkenntnisse darüber, wie T-DNA-Insertionen die lokale Epigenomumgebung beeinflussen können“, sagt Zander.

In einer idealen Welt, sagen die Forscher, würde T-DNA eine einzige, funktionsfähige Kopie eines gewünschten Gens ohne Nebenwirkungen auf das Genom einer Pflanze einfügen. Ihre Ergebnisse zeigen zwar, dass dies selten der Fall ist ArabidopsisIhre Methoden bieten einen Weg zu einem besseren Verständnis und einer besseren Überwachung der Auswirkungen.

„Diese Technologie ist aufregend, weil sie uns einen viel klareren Einblick in die Vorgänge in einigen dieser Transgenen gibt Arabidopsis Linien“, sagt Rivkin.

"Mit Arabidopsis, es ist relativ einfach, weil es ein so kleines Genom hat, aber aufgrund der kontinuierlichen Verbesserungen in der DNA-Sequenzierungstechnologie gehen wir davon aus, dass dieser Ansatz auch für Nutzpflanzen möglich sein wird“, fügt Ecker hinzu, der den Lehrstuhl für Genetik des Salk International Council innehat. „Aktuelle Methoden erfordern das Screening von Hunderten transgener Linien, um leistungsstarke Linien zu finden, beispielsweise solche ohne zusätzliche Insertionen. Daher könnte diese Technologie einen effizienteren Ansatz bieten.“

Weitere Forscher an der Studie waren Justin Sandoval, Huaming Chen, Rosa Castanon und Joseph Nery vom Salk Institute; Timothy Motley vom J. Craig Venter Institute; und Keith Slotkin vom Donald Danforth Plant Science Center.

Die Arbeit und die beteiligten Forscher wurden durch Zuschüsse des Human Frontier Science Program, des Salk Pioneer Postdoctoral Endowment Fund, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und des Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

DOI: 10.1371/journal.pgen.1007819