Neue Methode zur schnellen Kartierung der „sozialen Netzwerke“ von Proteinen

26. Juni 2017

Neue Methode zur schnellen Kartierung der „sozialen Netzwerke“ von Proteinen

Salk-Wissenschaftler haben einen klassischen Ansatz zur Kartierung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen verbessert

26. Juni 2017

LA JOLLA – Salk-Wissenschaftler haben eine neue Hochdurchsatztechnik entwickelt, um zu bestimmen, welche Proteine ​​in einer Zelle miteinander interagieren. Die Kartierung dieses Interaktionsnetzwerks oder „Interaktoms“ ging in der Vergangenheit nur langsam voran, da die Anzahl der Interaktionen, die gleichzeitig getestet werden konnten, begrenzt war. Der neue Ansatz, veröffentlicht am 26. Juni in Nature Methodsermöglicht es Forschern, Millionen von Beziehungen zwischen Tausenden von Proteinen in einem einzigen Experiment zu testen.

„Die Stärke dieses neuen Ansatzes liegt in der Fähigkeit, ihn jetzt zu erweitern“, sagt der leitende Autor Josef Ecker, Professor und Direktor des Genomic Analysis Laboratory von Salk und Forscher des Howard Hughes Medical Institute. „Dieser Assay hat das Potenzial, Fragen zu grundlegenden biologischen Wechselwirkungen zu beantworten, die wir bisher nicht beantworten konnten.“

Das Interaktom einer Zelle ermöglicht es Wissenschaftlern, wie eine Karte sozialer Netzwerke, zu sehen, wer in der Welt der Proteine ​​mit wem zusammenarbeitet. Dies hilft ihnen, die Rolle verschiedener Proteine ​​herauszufinden und die verschiedenen Akteure in molekularen Signalwegen und Prozessen zusammenzufassen. Wenn ein neu entdecktes Protein beispielsweise mit vielen anderen Proteinen interagiert, die am Zellstoffwechsel beteiligt sind, können Forscher ableiten, dass dies wahrscheinlich eine Rolle für das neue Protein ist, und es möglicherweise für Behandlungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen einsetzen.

Bisher haben sich Forscher in der Regel auf Standard-Hochdurchsatz-Hefe-Zwei-Hybrid-Assays (Y2H) verlassen, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen. Das System erfordert die Verwendung eines einzigen bekannten Proteins – bekannt als „Köder“ –, um gegen einen Pool von „Beute“-Proteinen zu screenen. Aber um alle Wechselwirkungen zwischen beispielsweise 1,000 Proteinen zu finden, wären 1000 separate Experimente erforderlich, um einmal die Interaktionspartner jedes Köders zu untersuchen.

„Aktuelle Technologien erfordern im Wesentlichen, dass im Primärscreening erkannte Wechselwirkungen einzeln erneut getestet werden“, sagt Shelly Trigg, NSF Graduate Research Fellow am University of California, San Diego, im Ecker-Labor und Erstautor der neuen Arbeit. „Das ist bei der Screening-Tiefe, die dieser Ansatz erreicht, möglicherweise nicht mehr notwendig.“

In ihrer neuen Methode haben Ecker, Trigg und ihre Kollegen den Standard-Y2H-Assay um eine viel effektivere Methode zur Messung des Interaktoms erweitert. Die Gene für zwei Proteine, jedes auf seinem eigenen DNA-Kreis, werden derselben Zelle hinzugefügt. Wenn die interessierenden Proteine ​​innerhalb der Zelle interagieren, wird ein Gen namens Cre aktiviert. Wenn Cre eingeschaltet ist, verbindet es die beiden einzelnen DNA-Kreise physisch miteinander und paart so die Gene interagierender Proteine, sodass das Team sie durch Sequenzierung leicht finden kann. Das Team kann eine riesige Bibliothek von Hefezellen erzeugen, von denen jede unterschiedliche Proteinpaare enthält, indem es zufällige Kombinationen von Genen in zirkulärer DNA, sogenannten Plasmiden, einführt. Wenn Zellen positiv auf eine Proteininteraktion reagieren, können die Forscher mithilfe der genetischen Sequenzierung herausfinden, um welche beiden Proteine ​​es sich handelt. Dabei nutzen sie neue Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechnologien, die denen ähneln, die für die Sequenzierung des menschlichen Genoms verwendet werden. Auf diese Weise sind sie nicht mehr darauf beschränkt, jeweils nur ein „Köder“-Protein zu testen, sondern können die Wechselwirkungen zwischen allen Proteinen in einer Bibliothek gleichzeitig testen.

Eckers Gruppe testete die neue Methode namens CrY2H-seq an allen Transkriptionsfaktoren – einer großen Klasse von Proteinen – in der Pflanze Arabidopsis.

„Wenn man 1,800 Proteine ​​nimmt und die Wechselwirkungen zwischen ihnen testet, sind das fast 4 Millionen Kombinationen“, sagt Ecker. „Das haben wir innerhalb eines Monats zehnmal gemacht.“

Sie deckten mehr als 8,000 Wechselwirkungen zwischen den getesteten Proteinen auf und verschafften ihnen neue Erkenntnisse darüber Arabidopsis Transkriptionsfaktoren interagieren miteinander. Sie sagen, dass die Daten dazu beitragen, langjährige Fragen darüber zu beantworten, ob bestimmte Gruppen von Transkriptionsfaktoren festgelegte Funktionen haben. Sie fanden heraus, dass einige der kaum verstandenen Transkriptionsfaktoren mit besser verstandenen Faktoren interagieren, die die Reaktion der Pflanze auf Auxin regulieren, ein Hormon, das an der Koordination des Pflanzenwachstums beteiligt ist.

In Zukunft könnte die Methode ausgeweitet werden, um größere Proteinmengen zu testen – menschliche Zellen enthalten beispielsweise etwa 20,000 verschiedene Proteine. Diese einfachere und schnellere Methode zur Bestimmung des gesamten Interaktoms einer Zelle eröffnet auch die Möglichkeit, zu untersuchen, wie sich das Interaktom unter verschiedenen Bedingungen verändert – ein Experiment, das in der Vergangenheit noch nie möglich war.

Weitere Forscher an der Studie waren Renee Garza, Andrew MacWilliams, Joseph Nery, Anna Bartlett, Rosa Castanon, Adeline Goubil, Joseph Feeney, Ronan O'Malley, Shao-shan Carol Huang, Zhuzhu Zhang und Mary Galli vom Salk Institute.

Die Arbeit und die beteiligten Forscher wurden durch Zuschüsse des gefördert US-Energieministerium, Graduierten-Forschungsstipendienprogramm der National Science Foundation, Howard Hughes Medical Institute und Mary K. Chapman Stiftung.