Die Technik der geneigten Mikroskopie zeigt Proteinstrukturen besser

Die Technik der geneigten Mikroskopie zeigt Proteinstrukturen besser

Forscher des Salk Institute beschreiben neue Kryo-EM-Methode, um ein besseres Verständnis der an Krankheiten beteiligten Proteine ​​zu ermöglichen

LA JOLLA – Die herkömmliche Methode, Proteinproben während Kryo-EM-Experimenten unter einem Elektronenmikroskop zu platzieren, kann scheitern, wenn es darum geht, das beste Bild der Struktur eines Proteins zu erhalten. In einigen Fällen liefert das Neigen einer Schicht gefrorener Proteine ​​– um 10 bis 50 Grad – während sie unter dem Mikroskop liegt, qualitativ hochwertigere Daten und könnte zu einem besseren Verständnis einer Vielzahl von Krankheiten führen, so eine neue Studie unter der Leitung von Salk Wissenschaftler Dmitri Ljumkis.

„Man hat schon früher versucht, Kippen zu implementieren, aber es gab viele Herausforderungen“, sagt Lyumkis, Helmsley-Salk-Stipendiat am Salk Institute und leitender Autor der neuen Arbeit, die am 3. Juli 2017 in veröffentlicht wurde Nature Methods. „Mit unserem neuen Ansatz haben wir viele dieser Probleme beseitigt.“

Kryo-EM oder Kryo-Elektronenmikroskopie ist eine Form der Transmissionselektronenmikroskopie, bei der Proben schnell auf unter den Gefrierpunkt abgekühlt werden, bevor sie unter dem Mikroskop abgebildet werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die üblicherweise zur Bestimmung der Struktur von Proteinen eingesetzt werden, ermöglicht die Kryo-EM, dass Proteine ​​für die Bildgebung in ihrer natürlichen Konformation verbleiben, was neue Informationen über die Strukturen liefern könnte. Das Verständnis der Proteinstrukturen ist ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung neuer Therapien für Krankheiten. etwa im Fall von HIV.

Forscher haben lange angenommen, dass Proteine ​​im gesamten gefrorenen Gitter, das für Kryo-EM-Experimente vorbereitet wurde, zufällige Konformationen annehmen. Das bedeutet, dass Forscher durch die Aufnahme ausreichender Bilder ein vollständiges 3D-Bild der Form(en) des Proteins aus allen Bildrichtungen zusammenstellen können. Doch bei vielen Proteinen scheint der Ansatz fehlzuschlagen, und Teile der Proteinstrukturen fehlen weiterhin.

„Forscher beginnen zu glauben, dass die Proteine ​​auf einem Kryo-EM-Gitter doch keine zufälligen Konformationen annehmen, sondern in bevorzugten Orientierungen am oberen oder unteren Rand des Probengitters haften bleiben“, sagt Lyumkis. „Daher erhalten wir möglicherweise nicht das vollständige Bild der Proteinstrukturen. Noch wichtiger ist, dass dieses Verhalten die Strukturbestimmung ausgewählter Proteinproben insgesamt verhindern kann.“

Um das Problem zu verstehen, stellen Sie sich vor, Sie würden versuchen, die Schatten von einem Dutzend Blechdosen zu betrachten, um deren Form herauszufinden, aber Sie sehen nur Kreise, weil alle Dosen genau aufrecht stehen. Wenn man das Licht – oder den Elektronenstrahl im Fall der Kryo-EM – jedoch in einem Winkel auf die Proben treffen lässt, könnte man die wahre Form besser erkennen.

Wenn Forscher in der Vergangenheit versucht haben, Proben unter einem Mikroskop zu neigen, waren sie durch eine schlechte Auflösung eingeschränkt: Ein Winkel bedeutet, dass der Elektronenstrahl durch ein dickeres Gitter wandern muss. Außerdem ist es wahrscheinlicher, dass sich Proben innerhalb des eingefrorenen Rasters bewegen, wenn sie geneigt werden, wodurch die Daten unscharf werden. Und technisch gesehen ist die Analyse von Daten einer geneigten Probe auch eine größere Herausforderung, da Kryo-EM-Methoden unter der Annahme entwickelt wurden, dass sich das Gitter mit den Proteinen immer im gleichen Abstand vom Mikroskop befindet.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, änderten Lyumkis und seine Kollegen die zur Erstellung des Kryo-EM-Gitters verwendeten Materialien, zeichneten Filme ihrer Daten anstelle von Standbildern auf und entwickelten neue Berechnungsmethoden zur Analyse der Informationen.

Als sie den neuen Ansatz am Influenza-Hämagglutinin-Protein testeten, einem bekanntermaßen schwer mit Kryo-EM zu charakterisierenden Protein, stellte das Team fest, dass das Kippen der Probe einen vollständigeren Datensatz lieferte. Wenn die Proteinprobe flach war, führten typische Algorithmen zu einer falsch positiven Form des Proteins, die nicht durch experimentelle Daten gestützt wurde. Beim Kippen war das nicht der Fall.

„Aufgrund der Geometrie der Datenerfassung, wenn wir neigen, füllen wir viel mehr Daten zur Charakterisierung der Moleküle auf und erhalten so ein vollständigeres Bild der Form des Proteins“, sagt Lyumkis.

Die Algorithmen, die Lyumkis und sein Team entwickelt haben – darunter Möglichkeiten zur Analyse, ob ein Kryo-EM-Experiment schlechte Daten liefert, sowie Methoden zur Interpretation eines geneigten Experiments – sind jetzt öffentlich verfügbar. Sie hoffen, dass andere Forscher damit beginnen, sie zu verwenden, und dass sie zu einer Standardmetrik für die Validierung von Kryo-EM-Strukturen wird (da die meisten experimentell abgeleiteten Strukturen in unterschiedlichem Ausmaß unter fehlenden Informationen leiden).

„Eine der Ideen, mit denen wir uns jetzt befassen, ist, ob die Datenerfassung immer schräg und nicht auf herkömmliche Weise erfolgen sollte“, sagt Lyumkis. „Es wird nicht schaden und es sollte helfen.“

Weitere Forscher an der Studie waren Yong Zi Tan, Philip Baldwin, Clinton Potter und Bridget Carragher von der New Yorker Zentrum für Strukturbiologie, und Joseph David und James Williamson von Das Scripps Forschungsinstitut.

Die Arbeit und die beteiligten Forscher wurden durch Zuschüsse des gefördert Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung Singapur, der Leona M. und Harry B. Helmsley Charitable Trust, die USA National Institutes of Health, der Jane Coffin Childs Foundation, der Nationales Institut für Altern, der Nationales Institut für Allgemeine Medizin und der Simons Foundation.